Restriktionsverdau mit AluI Probleme!

Hallo alle zusammen… ich habe ein Problem bei meiner Diplomarbeit.
Ich untersuche die alpha3Untereinheit des Glycin Rezeptors beim Menschen und muss dazu einen Restritkionsverdau machen. Ich habe als Enzyme AluI und HpyCH4III zur verfügung. Ich habe jetzt endlich meine PCR soweit in Gang dass ich ein einigermaßen ordentliches Produkt herausbekomme, aber mein Verdau klappt weder mit dem einen noch mit dem anderen Enzym… Ich habe nach dem Verdau entweder alles voller Schrott oder ich habe gar keine Bande mehr,nichtmal die des ursprünglichen Produktes… Woran kann das liegen?
Ich hab gelesen, dass man manchmal die Enzyme einfach so ohne weitere zutaten zum pcr produkt gibt? hilft das? oder dass man das Produkt vorher verdünnen soll, da die optimale DNA Konz. bei 0,02-0,1 mükrogramm/ml liegen soll. Ist das nicht etwas wenig?? Ich verdaue im moment eine Stunde lang. Werd es heute aber mal mit 2 stunden versuchen. Hat irgendwer von euch nen Tip was das problem sein könnte und wie ich es beheben kann?
Mein protokoll ist im moment

H2O: 11 mikroliter
10xpuffer 2 mikroliter (ich weiss nicht wie man hier das komische m macht…)
und enzym: 2 mikroliter

gesamt sind das 15 und ich gebe 5 DNA (PCR Produkt) dazu.

ich habe einen Durchgang mit dem unverdünnten Enzym gemacht (Alu: 1u/mikroliter und Hpy 0,5 u/mikrol.) und einen mit verdünntem enzym (jeweils 0,1 u/mikroliter)
Macht aber irgendwie keinen Unterschied…

Mein PCR Produkt hat eine Länge von ca 260 bp und nach dem verdau will ich ein fragment mit 25 und eins mit 235 haben…
Wäre toll wenn ihr Ideen dazu habt…

Hallo,

Wenn’s halt nicht klappt:

Achte darauf, dass Du den zum Enzym passenden Puffer verwendest, und in den passenden Mengen Enzym dazu gibst (steht auf dem Beipackzettel, wieviele U pro µg DNA). Achte auch auf die Inkubationszeiten und die Temperatur. Übermäßig lage Verdaus bringen i.d.R. nicht sehr viel.

Versuche es mit eine Positivkontrolle (Plasmid?)

Stelle sicher, dass Du 235bp- und 260bp-Produkte im Gel auch unterscheiden kannst. Das 25bp-Produkt wirst Du eh nicht sehen.

Ansonsten: Ein anderes Aliquot Enzym probieren (vielleicht ist das, das Du gerade nimmst, kaputt). Wenn nicht zur Hand, vielleicht im Nachbarlabor/Institut schnorren.

Viel Erfolg!
Jochen

Guten Tag,

Also unterscheiden kann ich die schon… wir benutzen den QIAxcel von QIAgen. der macht Elektrophorese und ich kann das bis aufs basenpaar genau sehen…
Als Puffer nehme ich den der mitgeliefert wurde. Und Inkubationszeit mache ich ne Stunde… kann eigentlich nicht zu lange sein…

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