Hi,
weiß jemand, woran es liegen könnte, dass in einer transformierten Pflanze neben den Vektor (Ti-Plasmid) mit Geninsert auch der Vektor ohne Geninsert nachweisbar ist (RT-PCR). Der verwendete Klon wurde überprüft, scheint also erst in der Pflanze zu passieren.
Gruß
nok
Hallo nok,
weiß jemand, woran es liegen könnte, dass in einer
transformierten Pflanze neben den Vektor (Ti-Plasmid) mit
Geninsert auch der Vektor ohne Geninsert nachweisbar ist
(RT-PCR).
Die RT-PCR nimmt mRNA als Template. Du hast also mRNAs revers transkribiert und dann mit einem spezifischen Primerpaar (Lage der Primer?) zwei unterschiedlich große Produkte erhalten, die sich nach der Sequenzierung als einerseits von einer „leeren“ T-DNA und von einer T-DNA mit Insert stammend herausgestellt haben, oder? Da liegt die Vermutung nahe, dass du zwei Transformationsereignisse erzeugt hast, wobei eine von einer leeren T-DNA und eine von einer T-DNA mit Insert herrühren.
Die Insertion von T-DNAs ist nicht so extrem exakt. Da können Anteile sowohl auf der Seite der LB als auch der RB fehlen, oder es kann zu Duplikationen u.s.w. kommen. Das ist nicht selten und könnte auch einiges erklären, aber nur, wenn du etwas mehr darüber erzählst, wie du genau vorgegangen bist und wo die Primer im Verhältnis zur cloning site bzw. zum Insert liegen.
Der verwendete Klon wurde überprüft, scheint also
erst in der Pflanze zu passieren.
Siehe oben: Wie wurde der Klon genau überprüft? Evtl. Negativkontrollen vergessen? Könnte er nicht doch zwei Vektoren (einen Leeren einen mit Insert) tragen?
LG
Huttatta
Hallo Huttatta,
danke schon einmal für deine Antwort.
Hier die Vorgehensweise etwas ausführlicher. Ich habe ein ca. 400 bp großes Fragment in die MCS des Vektors kloniert, in Agrobacterium transformiert und damit die Pflanzen infiziert. Nach 3 Wochen habe ich die Blätter der Pflanzen geerntet und die Gesamt-RNA extrahiert. Diese habe ich dann nach Überprüfung auf DNA zur reversen Transkription verwendet. Dabei habe ich als RT-Primer einen vektorspezifischen Primer, der hinter der MCS bindet, verwendet.
In der nachfolgenden PCR mit Verwendung von vektorspezifischen Primern, Forward-Primer bindet vor MCS (ca. 100 bp) und Reverse-Primer bindet hinter MCS (ca. 150 bp), wurde ein Fragment amplifiziert, dass in der Größe dem Vektor ohne Insert entspricht, also 400 bp von der erwarteten Größe abwich.
Wurde aber eine PCR, mit dem vektorspezifischen Forward-Primer und einem Reverse-Primer der spezifisch an die Sequenz des Inserts bindet, durchgeführt, zeigte das amplifizierte Fragment die erwartete Größe.
Zur Überprüfung des verwendeten Klon wurde zum Einen die Plasmid-DNA extrahiert und mit den vektorspezifischen Primern einer PCR unterzogen (ein Fragment amplifiziert, Größe entsprach dem Vektor mit Geninsert) und zum Anderen die Plasmid-DNA sequenziert (vektorspezifischer Primer).
Daher war unsere Vermutung, dass der Klon in Ordnung war und in der Pflanze ein Verlust des Inserts erfolgt. Dies könnte auch erklären, warum ein Gen-Silencing nicht beobachtet wurde.
Hast du eine Idee, woran es liegen könnte?
Gruß
nok
Hallo nok,
Nach 3 Wochen habe ich die Blätter der Pflanzen geerntet und
die Gesamt-RNA extrahiert. Diese habe ich dann nach
Überprüfung auf DNA zur reversen Transkription verwendet.
Keinen DNAse-Verdau gemacht?
Dabei habe ich als RT-Primer einen vektorspezifischen Primer,
der hinter der MCS bindet, verwendet.
Kein Oligo-dT-Primer?
In der nachfolgenden PCR mit Verwendung von vektorspezifischen
Primern, Forward-Primer bindet vor MCS (ca. 100 bp) und
Reverse-Primer bindet hinter MCS (ca. 150 bp), wurde ein
Fragment amplifiziert, dass in der Größe dem Vektor ohne
Insert entspricht, also 400 bp von der erwarteten Größe
abwich.
Wurde aber eine PCR, mit dem vektorspezifischen Forward-Primer
und einem Reverse-Primer der spezifisch an die Sequenz des
Inserts bindet, durchgeführt, zeigte das amplifizierte
Fragment die erwartete Größe.
Siehe oben: Ich wäre mir da nicht 100% sicher, ausschließlich cDNA amplifiziert zu haben. Dennoch sollte das nicht so sein, wenn der Klon in Ordnung ist.
Zur Überprüfung des verwendeten Klon wurde zum Einen die
Plasmid-DNA extrahiert und mit den vektorspezifischen Primern
einer PCR unterzogen (ein Fragment amplifiziert, Größe
entsprach dem Vektor mit Geninsert) und zum Anderen die
Plasmid-DNA sequenziert (vektorspezifischer Primer).
Verstehe.
Daher war unsere Vermutung, dass der Klon in Ordnung war und
in der Pflanze ein Verlust des Inserts erfolgt. Dies könnte
auch erklären, warum ein Gen-Silencing nicht beobachtet wurde.Hast du eine Idee, woran es liegen könnte?
Hmm, das Einzige, was mir gerade einfällt ist, dass bei der Insertion wie gesagt immer mal Fehler passieren können. Ich könnte mir vorstellen, dass das durch das Vorhandensein benachbarter revers komplementärer Sequenzen (du willst vermutlich eine shRNA exprimieren) stark begünstigt wird, zumal die T-DNA einzelsträngig übertragen wird. Mit den DNA-Reparaturmechanismen kenne ich mich leider nicht aus, deshalb ist es hochspekulativ, aber vielleicht bilden sich dann vermehrt DNA-Hairpins, die bei der Reparatur beseitigt werden. Das würde möglcherweise erklären, warum bei einigen Insertionen eben genau das Vektor-Insert fehlt. Wenn das so wäre, solltest du aber mit den vektorspezifischen Primern zwei Produkte erhalten und mit dem Insertspezifischen Primer nur eines.
Fazit: Ich bin jetzt doch auch ratlos. Hast du’s mal anders herum versucht, also mit vektorspezifischem Reverse Primer und insertspezifischem Forward Primer (am besten gleiche Priming Site wie insertspezifischer Reverse Primer)?
LG
Huttatta
Hallo Huttata,
danke dir für deine Antwort.
Keinen DNAse-Verdau gemacht?
Natürlich wurde die RNA verdaut und zeigte bei einer Überprüfung per PCR (vektorspezifische Primer sowie insertspezifische Primer) keine restliche DNA.
Kein Oligo-dT-Primer?
Die cDNA-Synthese mit Oligos bzw. mit Random Hexamer-Primer war nicht sehr effizient, so dass eben ein vektorspezifischer RT-Primer verwendet wurde.
Hast du’s mal anders herum versucht,also mit vektorspezifischem Reverse
Primer und insertspezifischem Forward Primer (am besten gleiche Priming
Site wie insertspezifischer Reverse Primer)?
Ja, habe ich. Es konnte ein Fragment amplifiziert werden, dass von der Größe korrekt war.
Fazit: Ich bin jetzt doch auch ratlos.
Trotzdem vielen Dank für deine Antwort.
Gruß
nok
Hallo nok,
Hast du’s mal anders herum versucht,also mit vektorspezifischem Reverse
Primer und insertspezifischem Forward Primer (am besten gleiche Priming
Site wie insertspezifischer Reverse Primer)?Ja, habe ich. Es konnte ein Fragment amplifiziert werden, dass
von der Größe korrekt war.
das würde ja passen. Irgendwie - auf welche Weise auch immer - geht offenbar das Insert zumindest teilweise in der Pflanze verloren. Ich vermute jetzt mal, dass es tatsächlich an der Sequenz des Inserts liegen könnte. Enthält es revers komplementäre Elemente?
LG
Huttatta