PCR - keine Banden mehr

Ich beschäftige mich seit kurzem mit PCR. Ich habe eine PCR mit zwei Röhrchen aus der gleichen DNA-Probe gemacht. Als ich die Produkte dann bei der Elektrophorese laufen liess, zeigte ein Produkt eine gute, starke Bande, das zweite nur eine sehr schwache. Da die Produktmenge zu gering war um damit weiter zu arbeiten, habe ich die PCR mit vier Rörchen aus der gleichen DNA-Probe wie am Vortag wiederholt. Bei der nächsten Elektrophorese waren gar keine Banden mehr zu sehen. Um Fehler auszuschliessen, wurde die PCR wiederholt und zwar mit unterschiedlichen Annealing-Temperaturen. Doch wiederum gab es keine Banden.
Kann sich jemand erklären, warum am ersten Tag Banden vorhanden waren, zwar unterschiedlich stark ausgeprägt, und in den darauf folgenden Tagen plötzlich nicht mehr?
Danke!

Ich beschäftige mich seit kurzem mit PCR. Ich habe eine PCR
mit zwei Röhrchen aus der gleichen DNA-Probe gemacht. Als ich
die Produkte dann bei der Elektrophorese laufen liess, zeigte
ein Produkt eine gute, starke Bande, das zweite nur eine sehr
schwache.

Ich gehe davon aus, dass die Reaktionsansätze identisch sein sollten und dass das gleiche Programm im Thermocycler lief. Das kann bei einzeln pipettierten Reaktionsansätzen schon mal passieren, wenn etwas ungenau pipettiert wurde. Darum ist bei mehreren parallel laufenden Reaktionen ein Mastermix zu bevorzugen, bei dem die zu pipettierenden Mengen größer sind und der Fehler kleiner ist. Außerdem ist es sinnvoll, die in der Pipettenspitze aufgezogene Menge stets optisch (Pi mal Daumen) zu kontrollieren.

Kann sich jemand erklären, warum am ersten Tag Banden
vorhanden waren, zwar unterschiedlich stark ausgeprägt, und in
den darauf folgenden Tagen plötzlich nicht mehr?
Danke!

Das ist ohne genaue Schilderung deiner Vorgehensweise reine Spekulation. DNA kaputt? Polymerase kaputt? Falsch pipetiert? Wurden die Reaktionsansätze auf Eis zusammenpipettiert und wurden alle Zutaten nach der Entnahme aus dem Kühlschrank bis zum erneuten Einfrieren ebenfalls kontinuierlich auf Eis gelagert? Hast du alle Zutaten vor der Entnahme einmal kurz gevortext? Hast du die Zutaten jeweils in die vorgelegten Zutaten mit eingetauchter Spitze hineinpipettiert (bevorzugte Methode) oder hast du sie an die Wand des Tubes pipettiert? Hast du im zweiteren Fall die Tubes auch kurz abzentrifugiert? Hast du immer schön die Pipettenspitze gewechselt, um nicht deine Arbeitslösungen zu kontaminieren? Hast du beim Zusammenpipettieren des Reaktionsansatzes folgende Reihenfolge eingehalten?

  1. dH2O für PCR
  2. Puffer
  3. MgCl2 (falls nicht bereits im Puffer)
  4. dNTP
  5. Primer
  6. Template
  7. Polymerase (immer zuletzt und unmittelbar vorm Cyclen)

Wurde vielleicht am Thermocycler die Deckelheizung vergessen? Falls der keine Deckelheizung hat, wurden die Proben mit Mineralöl überschichtet? Außerdem kann immer wieder alles auf kleine Pipettierfehler zurückzuführen sein, die sich bis hin zu 0 Produkt zusammenaddieren. Am besten schilderst du mal genau, wie du vorgegangen bist, aber möglicherweise sind meine Fragen für dich schon Hinweis genug.

LG
Huttatta