Proteinkristallisation
Von: , Frage gestellt am Di, 23. Sep 2003
Hallo,
weiß jemand, bei welchen ph-Wert die Kristallisation von Proteinen am besten funktioniert?
Gruß
Oliver
7 Antworten zu dieser Frage
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Antwort von nach einer Stunde 1 hilfreich
Re: Proteinkristallisation
Hallo,
das ist sicher abhängig davon, welches Protein du kristallisieren willst. Für Proteine, die schon kristallisiert wurden, kannst du das ja nachlesen. Für neue Proteine setzt man idR unterschiedliche Lösungen an, um den optimalen pH zu finden.
Gruß,
Jochen
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Antwort von nach 16 Stunden 1 hilfreich
Re: Proteinkristallisation
Hallo Oliver,
weiß jemand, bei welchen ph-Wert die Kristallisation von
Proteinen am besten funktioniert?
wie Jo schon schrieb, das hängt stark(!) von der Struktur des Proteins ab.
Eine Variante z.B. orientiert sich an Isoelektrischen Punkt.
Um den zu bestimmen, gibt es die Methode der Isoelektrischen Fokusierung. Details gibt es in der einschlägigen Literatur und da ich das vor über zwanzig Jahren zum letzten mal gemacht hab, hat sich die Technik sicher weiterentwickelt.
Dann stellt sich die Frage, was Du mit der Kristallisation bezwecken willst. Reinigung oder die Herstellung von EInkristallen für die Röntgenbeugung.
Wenns nur die Reinigung ist, kannst Du ev. auch umfällen, also mit einem guten Lösemittel(gemisch) oder einem Puffer lösen und mit einem schlechten Löser langsam versetzen, bis das Protein ausfällt. Oder einen pH-Gradienten fahren.
Aber jeder, der sich ernsthaft mit der Kristallisation von Proteinen auseinandergesetzt hat, wird Dir sagen, daß das weniger eine Wissenschaft, als vielmehr eine Kunst ist, die viiiiiiiel Erfahrung und handwerkliches Geschick erfordert.
Es gibt Menschen, die in der Lage sind, Proben zu kristallisieren, die andere jahrelang bearbeitet haben, ohne es geschafft zu haben.
Von einem Mitarbeiter Warburgs sagte man:
Wenn der sich in die Hände spuckt kristallisiert das aus.
Gandalf
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Antwort von nach einem Tag 0 hilfreich
Danke, Euch beiden!!
Danke für die Antworten. Aber jeder, der sich ernsthaft mit der Kristallisation von
Proteinen auseinandergesetzt hat, wird Dir sagen, daß das
weniger eine Wissenschaft, als vielmehr eine Kunst ist, die
viiiiiiiel Erfahrung und handwerkliches Geschick erfordert.
Oh nein.... das habe ich befürchtet!!
Gruß
Oliver
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Antwort von nach 5 Tagen 0 hilfreich
Re: Proteinkristallisation
Hi Olli,
wie von Jo und Gandalf bereits geschrieben, eine allgemeine Aussage ist da kaum zu treffen, Kristallisationsbedingungen gibt es wie Sand am Meer und Du brauchst nicht nur einen bestimmten pH, sondern auch noch genau definierte Salzkonzentrationen, die optimale Temperatur und ein hinreichend langsames Wachstum, nicht zu vergessen ein SEHR sauberes Protein (in der Regel ist die Aufreinigung schon eine Wissenschaft für sich) in ausreichender Konzentration, unter 5 mg / ml würde ich gar keine Screens ansetzen.....für den pH und die Salzbedingungen gilt grob, daß man mit einigermaßen physiologischen Werten (gemeint ist hier, was für das Protein für ein Milieu in vivo hat) oft nicht zu schlecht beraten ist. Bedenke, daß es sonst alle möglichen, fiesen Effekte geben kann, da Proteine in der Regel bezüglich ihrer Ladungen recht sensitiv sind (und gerade der pH ändert die z.T. drastisch!!!!!).
Ein Protein so zu kristallisieren, daß Du es am der beam line wirklich röntgendiffraktometrisch untersuchen kannst, ist mind. eine Diplomarbeit. Im Zweifel wende Dich an die Leute vom EMBL oder eine strukturbiochemische Abteilung Deines Vertrauens, ich weiß, daß an diversen Stellen (HH, Heidelberg, Freiburg, München u.v.m.) sehr fähige Leute sitzen. Wofür brauchst Du denn einen Proteinkristall??????
regards,
Felix [Bei dieser Antwort wurde das Vollzitat nachträglich automatisiert entfernt]
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Antwort von nach 7 Tagen 0 hilfreich
Re^2: Proteinkristallisation
Wie schon meine Vorredner geschrieben haben brauchst Du möglichst reines Protein normalerweise > 95 % Reinheit = auf einem Silbergel keine oder fast keine weiteren Banden, wenn du es nicht reiner bekommst kannst du es aber auch mit dreckiger Lösung probieren. In der Proteinkristallographie kann man immer Glück haben.
Die Kristallisationsbedingungen würde ich zunächst mit Hamptonscreen 1 und 2 austesten, wenn Du hier Kristalle bekommst kannst Du weiter an die Bedingungen verändern, bei denen Kristalle entstanden sind bis die Kristalle optimal und schön groß wachsen. Wieviel Protein Du brauchst hängt von der Tropfengröße ab, Du kannst ruhig für den Anfang sehr kleine Tropfen pipetieren (z.B. 0,5 um Protein, 0,5 um Reservoirlösung). Ich würde mit einer Proteinkonzentration von etwa 10 mg/ml anfangen. Wenn Du Kristalle bekommst änderst Du die Bedingungen in denen sie entstanden sind ein klein wenig (ausprobieren), bis die Kristalle optimal wachsen.
Leider ist es oft so, daß man auch mit einigen Hundert Ansätzen keine Kristalle erhält.
Wenn Du ernsthaft an Proteinkristallographie interessiert bist, ließ oder es z.B. im Ramen einer Doktorarbeit machen mußt, ließ Dir entsprechende Literatur durch, ansonsten: vergiß es.
Ein Protein aufreinigen, kristallisieren und die Struktur lösen, kann durchaus eine ganze Doktorarbeit (2-3 Jahre) sein.
Viel Glück
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Antwort von nach 5 Tagen 0 hilfreich
Re^2: Proteinkristallisation
Hallo, Wofür
brauchst Du denn einen Proteinkristall??????
Mir ist eine Diplomarbeit angeboten worden an einem Institut, das ein System zur automatisierten Proteinkristallisation entwickeln will. Aber ich weiß noch nicht so recht... hört sich nach ziemlich viel Fuddelei an.
Andererseits wärs doch echt cool, wenn man sich Proteeinkristalle wie in einem Kaffeeautomat einfach zubereiten lassen kann.
Hmmm...
Gruß
Oliver
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Antwort von nach 6 Tagen 0 hilfreich
Re^3: Proteinkristallisation
Hi Olli,
hmm, es gibt schon Kristallisationsroboter, die nach vorprogrammierten Schemata Mikrotiterplatten ansetzen können. Bei automatisierter Proteinkristallisation hab ich nur Bedenken, weil die Beurteilung der Kristalle meiner Ansicht nach nicht automatisiert werden kann. Es gehört unglaublich viel Expertise dazu, an den Parametern zu schrauben, um erfolgreiche Kristalle zu züchten und selbst die besten Kristallographen, die ich kenne, sagen alle, ein bißchen Vodoo ist immer dabei. Kristalle zu züchten, ist eine Sache. Kristalle zu züchten, die auch noch streuen im beam, eine ganz Andere. Außerdem gibt es immer das Problem, daß es ein schrittweiser Prozeß ist, sich an die optimalen Bedingungen für das Kristallwachstum heranzutasten.....erst hast Du Präzipitate, dann Öle, dann Mikrokristalle, dann impfst Du an, dann tust Du dieses, dann jenes, dann tanzt Du um Deine Kristallplatte herum.....und schwups, hast Du einen Proteinkristall......automatisiertes Verfahren klingt gut, ist in Grenzen sicher machbar, aber ich bin da eher skeptisch, denn es gibt nicht DIE Kristallisationsbedingungen. Und wie in einem Kaffeeautomaten geht es ganz sicher nicht. Schön, wenn da jemand dran glaubt, daß es so einfach ist wie Genomsequenzierung, aber die Realität zeigt uns, daß das Proteom eben doch 'n bißchen komplexer ist......und so auch die Eigenschaften der Proteine. Wenn Du Lust hast, erzähl mal ein bißchen mehr über die Dipl.Arbeit, aber wenn Dir einer verkaufen will, daß Proteinkristallographie so einfach ist wie Kuchen backen, dann ist er entweder ein Spinner, ein Idealist oder ein Anwärter auf den nächsten Nobelpreis......in genau dieser Reihenfolge?!
Gruß
Felix
Mir ist eine Diplomarbeit angeboten worden an einem Institut,
das ein System zur automatisierten
Proteinkristallisation entwickeln will. Aber ich weiß noch
nicht so recht... hört sich nach ziemlich viel Fuddelei an.
Andererseits wärs doch echt cool, wenn man sich
Proteeinkristalle wie in einem Kaffeeautomat einfach
zubereiten lassen kann.
Hmmm...
Gruß
Oliver
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