hallo!
habe eine frage in der uni zu beantworten:
Der genetische abstand der marker leu1 und trp5 ist relativ groß. Für kopplungsstudien wäre ein marker etwa in der mitte dieser strecke vorteilhaft. Skizzieren sie, wie sie an diese aufgabe herangehen und wie sie dort mit hilfe reverser genetik einen marker schaffen können.
wäre für tips/ lösungsvorschläge dankbar!
Hallo Heike,
ich weiß zwar nicht, für welchen Organismus das genannte Beispiel gilt und mit welchem Abstand die beiden Marker gekoppelt sind. Liegt der Abstand eher im Bereich von 1 cM oder eher von 10-30 cM?
Im ersteren Fall wäre wohl eine Lösungsmöglichkeit eine ggf. vorhandene BAC- (oder YAC-) Bank zu nutzen. Man kann mit den Markern leu1 und trp5, falls dafür Sequenzen bekannt sind, die BAC-Bank screenen und ggf. einen BAC-Contig erstellen. Von Klonen, die jeweils leu1 oder trp5 enthalten kann man BAC-Endsequenzen gewinnen, wiederum als Marker verwenden und rückkartieren.
Wenn die Populationsgröße hoch genug ist, dann sollten sich Marker finden lassen, die innerhalb des gewünschten Intervalls liegen. Den Vorgang kann man wiederholen, so lange bis man in der Mitte des Zielintervalls ankommt.
Ob dieser Weg in deinem Fall machbar ist, das kann ich leider nicht beurteilen. Wenn du mir mehr Infos geben kannst (Organismus, welche Ressourcen sind vorhanden, wie groß ist das Intervall zwischen leu1 und trp5?), dann finden sich vielleicht noch andere Straegien.
Viele Grüße
Eva
hallo!
genauere angaben habe ich leider nicht; organismus usw. sind alles frei wählbar, also würde ich sagen, einer mit vollständig sequenziertem genom wäre gut z.b. saccharomyces cerevisiae. welche techniken könnte ich denn anwenden, um einen marker mittels reverser genetik zu machen? mir fällt bei reverser genetik immer nur gendisruption ein, aber nützt mir das was?
Hallo Heike,
nun, wenn du ein vollständig sequenziertes Genom hast, dann suche dir in einer Sequenzdatenbank in der Gensequenz, die zwischen den Markern (=Genen) leu1 und trp5 liegt ein weiteres Gen (oder auch einen nichtcodierenden DNA-Abschnitt) und entwickle einen Marker auf PCR-Basis damit. Solche Marker werden auch als STS-Marker (sequence tagged site) bezeichnet. Primerdesignprogramme gibt es frei im Internet (z.B. Primer3). Müßte bei Hefe eigentlich klappen. Auch dieser Marker wird wieder rückkartiert, da aus physikalischen Abständen (in bp) nicht unbedingt auf genetische Abstände (cM) geschlossen werden kann.
Gruß
Eva
danke! sowas ähnliches hab ich mir auch gedacht, ich weiß aber nicht, wie ich das dann selektieren soll, es sind ja nicht alle gene geeignet, oder? ich hab z.b. das gen ate1 gefunden, aber: *Null ate1 mutants are viable but lack the Arg-transferase activity and are unable to degrade those substrates of the N-end rule pathway that start with residues recognized by the Arg-transferase.*
viable -> wie soll ichs dann kartieren?
[Bei dieser Antwort wurde das Vollzitat nachträglich automatisiert entfernt]
Hallo Heike,
danke! sowas ähnliches hab ich mir auch gedacht, ich weiß aber
nicht, wie ich das dann selektieren soll, es sind ja nicht
alle gene geeignet, oder? ich hab z.b. das gen ate1 gefunden,
aber: *Null ate1 mutants are viable but lack the
Arg-transferase activity and are unable to degrade those
substrates of the N-end rule pathway that start with residues
recognized by the Arg-transferase.*
viable -> wie soll ichs dann kartieren?
ich dachte an eine Kartierung auf DNA-Ebene. Mit den Hefemutanten kenne ich mich leider zu wenig aus.
Das würde aber voraussetzen, daß du auch für leu1 und trp5 einen Marker auf DNA-Ebene entwickelst (z.B. PCR-gestützt) und diese beiden Marker und den/die neuen Marker in einer spaltenden Population kartierst. Dazu müßte DNA von den Individuen der spaltenden Population analysiert werden. Sequenzen, die zwischen den Kreuzungseltern polymorph sind, sollten auch in der Nachkommenschaft spalten.
Hilfts weiter?
Gruß
Eva
ich dachte an eine Kartierung auf DNA-Ebene. Mit den
Hefemutanten kenne ich mich leider zu wenig aus.
Das würde aber voraussetzen, daß du auch für leu1 und trp5
einen Marker auf DNA-Ebene entwickelst (z.B. PCR-gestützt) und
diese beiden Marker und den/die neuen Marker in einer
spaltenden Population kartierst. Dazu müßte DNA von den
Individuen der spaltenden Population analysiert werden.
Sequenzen, die zwischen den Kreuzungseltern polymorph sind,
sollten auch in der Nachkommenschaft spalten.Hilfts weiter?
Gruß
Eva
hmm, ich hab noch einige angaben gefunden:
möglicher lösungsweg ist die gendisruption; sequenz muss vorhanden sein; das gen muss einen phänotyp haben; disruption darf nicht lethal sein;
anderer möglicher lösungsweg über resistenz als marker (gendisruptionskassette, homologe rekombination);
wieso darf beim 1.lösungsvorschlag die disruption nicht lethal sein?
Hallo Heike,
ich müßte mich erst mal in die Möglichkeiten der Gendisruption einarbeiten, wozu mir aber grad etwas die Zeit fehlt.
Vielleicht findest du aber hier:
http://rothsteinlab.hs.columbia.edu/preprints/effici…
brauchbare Infos?
hmm, ich hab noch einige angaben gefunden:
möglicher lösungsweg ist die gendisruption; sequenz muss
vorhanden sein; das gen muss einen phänotyp haben; disruption
darf nicht lethal sein;
anderer möglicher lösungsweg über resistenz als marker
(gendisruptionskassette, homologe rekombination);
wieso darf beim 1.lösungsvorschlag die disruption nicht lethal
sein?
Hm, so aus dem hohlen Bauch kann ich das auch nicht sagen.
Tut mir leid, wenn ich hier im Moment nicht weiterhelfen kann.
Viele Grüße
Eva