M-RNA künstlich hergestellt +Translationssystem=?

Wissenschaft Biologie
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Hallo,

Wenn ich eine m-RNA künstlich herstelle mit nur zwei Nucleotide mit den Basen Uracil und Guanin nennt man das ja Poly-UG…

gut wenn ich dazu jetzt alles dazugebe was für eine Translation notwendig ist ensteht ja ein Protein!

was passiert jetzt aber wenn ich eine radioaktiv markierte Valin und Cystein (14C-Cystein) Aminosäure dazu gebe (14C-Valin) Dazu drei Versuche:

  1. Valin + Poly-UG + Cystein
    2.Valin + Pol-UG
  2. Valin + Cystein

Habe dazu eine Grafik Diagramm stehen: links auf der Achse ist der Valin Einbau my mol/ml und rechts eben die Zeit von 0-30min

  1. versuch = kurve geht sehr weit nach oben
  2. versuch = kurve bleibt sehr weit unten
  3. versuch = kurve bleibt fast ganz unten

Ich weiß ,dass zu erklären ist irgendwie nicht so toll aber vielleicht kann mir trotzdem jemand helfen :wink:

mfg
Vale

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Hallo Vale,

Wenn ich eine m-RNA künstlich herstelle mit nur zwei
Nucleotide mit den Basen Uracil und Guanin nennt man das ja
Poly-UG…

Dann, wenn immer ein G auf ein U folgt und ein U auf ein G, also so (Nennen wir das Fall 1): UGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUG…

Wenn du U und G beliebig aneinanderreihst, nennt man das nicht Poly-UG (ich glaube, das hat dann keinen speziellen Namen). Nennen wir das Fall 2.

gut wenn ich dazu jetzt alles dazugebe was für eine
Translation notwendig ist ensteht ja ein Protein!

Für eine Translation braucht deine mRNA noch eine Ribosomenbindestelle und ein Translationsstart-Signal (das sind beides bestimmte Sequenzen, bevor deine G’s und U’s anfangen). Außerdem noch die Metionin-tRNA, die das Startsignal (AUG) erkennt.

Im Fall 1 würde das Ribosom 2 mögliche Codone lesen: GUG und UGU (und zwar egal, ob deine codierende sequenz mit einem G oder einem U anfängt.

Im Fall 2 gibt es natürlich mehrere Möglichkeiten: GGG, GGU, GUG, UGG, UUG, UGU und UUU.

was passiert jetzt aber wenn ich eine radioaktiv markierte
Valin und Cystein (14C-Cystein) Aminosäure dazu gebe
(14C-Valin)

Aus dieser Fragestellung schließe ich, daß Fall 1 der richtige Fall ist. Denn UGU codiert für Cystein und GUG codiert für Valin (kannst du in der Codesonne nachlesen).

Unabhängig davon passiert dann aber nichts! Du darfst nicht die freien Aminosäuren zugeben, sondern die entsprechenden, mit den Aminosäuren beladenen tRNA’s (Cystein-Aminoacyl-tRNA und Valin-Aminoacyl-tRNA).

Dazu drei Versuche:

  1. Valin + Poly-UG + Cystein

Es ist alles da. Findet das Ribosom ein UGU, lagert sich eine Cystein-tRNA an und das Cystein wird an die Peptid-Kette angehängt. Findet es hingegen ein GUG, dann baut es entsprechend Valin ein.

2.Valin + Pol-UG

Hier fehlt Cystein (bzw. die Cystein-tRNA). Was soll also das Ribosom machen, wenn es an ein UGU kommt? Es wird eine Weile warten, aber es findet sich keine passende tRNA für dieses Codon. Dann wird es aufgeben. Es entsteht kein Polypeptid. Wenn die Sequenz mit einem G startet, dann ist das erste Codon ja ein GUG und Valin wird an das Methionin angehängt und es entsteht ein Dipeptid. Das war’s dann.

  1. Valin + Cystein

Hier fehlt ja die mRNA, also gibt es überhaupt keine Translation.

Habe dazu eine Grafik Diagramm stehen: links auf der Achse ist
der Valin Einbau my mol/ml und rechts eben die Zeit von
0-30min

Bevor man den Einbau messen kann (der ist ja proportional zur Menge der Radioaktivität, weil die Aminosäure radioaktiv markiert sind) müssen die noch übrigen Aminoacyl-tRNA’s (mit den nicht-eingebauten, aber auch radioaktiven Aminosäuren) abgetrennt werden. Dazu muß das Protein aus der Lösung aufgereinigt werden.

  1. versuch = kurve geht sehr weit nach oben

Klar, hier wird ja Protein gemacht.

  1. versuch = kurve bleibt sehr weit unten

??? Womöglich spielt der Fragesteller auf das Dipeptid an, aber das würde man nach der Aufreinigung verloren sein. Theoretisch würde sich also eine solche Kurve ergeben, praktisch aber nicht (höchstens als Meßfehler). Man kann sowas trotzdem Messen, aber mit aufwändigeren Techniken (Chromatographie+Radiographie), aber das ist tricky.

  1. versuch = kurve bleibt fast ganz unten

Hier ist ja auch überhauptnichts entstanden. Die radioaktiven Aminosäuren (an den tRNA’s, du erinnerst dich?) sind ja bei der Aufreinigung alle entfernt worden.

Ich weiß ,dass zu erklären ist irgendwie nicht so toll aber
vielleicht kann mir trotzdem jemand helfen :wink:

Was war eigentlich deine Frage?

Grüße,
Jochen

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Danke schonmal für die Antworten :wink: haben mir sehr viel geholfen!!! Ein paar Fragen noch:

Welche Untersuchungen müsste ich noch machen um deine Ergebnise noch weiter zu belegen ??

und was ist denn diese komische valin einbau in my mol/min ??? wieviel valin da jetzt eingebaut wird oder wie?

Beim anderen Diagramm steht halt Cystein- Einbau my mol/min dran und die Kurven sind ähnlich aber nicht gleich warum ???

Wieso hat Versuch 2 und 3 trotzdem eine Kurve obwohl quasi keine Proteinsynthese vollzogen wird??

mfg
Vale

Hallo Vale,

Wenn ich eine m-RNA künstlich herstelle mit nur zwei
Nucleotide mit den Basen Uracil und Guanin nennt man das ja
Poly-UG…

Dann, wenn immer ein G auf ein U folgt und ein U auf ein G,
also so (Nennen wir das Fall 1): UGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUG…

Wenn du U und G beliebig aneinanderreihst, nennt man das nicht
Poly-UG (ich glaube, das hat dann keinen speziellen Namen).
Nennen wir das Fall 2.

gut wenn ich dazu jetzt alles dazugebe was für eine
Translation notwendig ist ensteht ja ein Protein!

Für eine Translation braucht deine mRNA noch eine
Ribosomenbindestelle und ein Translationsstart-Signal (das
sind beides bestimmte Sequenzen, bevor deine G’s und U’s
anfangen). Außerdem noch die Metionin-tRNA, die das
Startsignal (AUG) erkennt.

Im Fall 1 würde das Ribosom 2 mögliche Codone lesen: GUG und
UGU (und zwar egal, ob deine codierende sequenz mit einem G
oder einem U anfängt.

Im Fall 2 gibt es natürlich mehrere Möglichkeiten: GGG, GGU,
GUG, UGG, UUG, UGU und UUU.

was passiert jetzt aber wenn ich eine radioaktiv markierte
Valin und Cystein (14C-Cystein) Aminosäure dazu gebe
(14C-Valin)

Aus dieser Fragestellung schließe ich, daß Fall 1 der richtige
Fall ist. Denn UGU codiert für Cystein und GUG codiert für
Valin (kannst du in der Codesonne nachlesen).

Unabhängig davon passiert dann aber nichts! Du darfst nicht
die freien Aminosäuren zugeben, sondern die entsprechenden,
mit den Aminosäuren beladenen tRNA’s (Cystein-Aminoacyl-tRNA
und Valin-Aminoacyl-tRNA).

Dazu drei Versuche:

  1. Valin + Poly-UG + Cystein

Es ist alles da. Findet das Ribosom ein UGU, lagert sich eine
Cystein-tRNA an und das Cystein wird an die Peptid-Kette
angehängt. Findet es hingegen ein GUG, dann baut es
entsprechend Valin ein.

2.Valin + Pol-UG

Hier fehlt Cystein (bzw. die Cystein-tRNA). Was soll also das
Ribosom machen, wenn es an ein UGU kommt? Es wird eine Weile
warten, aber es findet sich keine passende tRNA für dieses
Codon. Dann wird es aufgeben. Es entsteht kein Polypeptid.
Wenn die Sequenz mit einem G startet, dann ist das erste Codon
ja ein GUG und Valin wird an das Methionin angehängt und es
entsteht ein Dipeptid. Das war’s dann.

  1. Valin + Cystein

Hier fehlt ja die mRNA, also gibt es überhaupt keine
Translation.

Habe dazu eine Grafik Diagramm stehen: links auf der Achse ist
der Valin Einbau my mol/ml und rechts eben die Zeit von
0-30min

Bevor man den Einbau messen kann (der ist ja proportional zur
Menge der Radioaktivität, weil die Aminosäure radioaktiv
markiert sind) müssen die noch übrigen Aminoacyl-tRNA’s (mit
den nicht-eingebauten, aber auch radioaktiven Aminosäuren)
abgetrennt werden. Dazu muß das Protein aus der Lösung
aufgereinigt werden.

  1. versuch = kurve geht sehr weit nach oben

Klar, hier wird ja Protein gemacht.

  1. versuch = kurve bleibt sehr weit unten

??? Womöglich spielt der Fragesteller auf das Dipeptid an,
aber das würde man nach der Aufreinigung verloren sein.
Theoretisch würde sich also eine solche Kurve ergeben,
praktisch aber nicht (höchstens als Meßfehler). Man kann sowas
trotzdem Messen, aber mit aufwändigeren Techniken
(Chromatographie+Radiographie), aber das ist tricky.

  1. versuch = kurve bleibt fast ganz unten

Hier ist ja auch überhauptnichts entstanden. Die radioaktiven
Aminosäuren (an den tRNA’s, du erinnerst dich?) sind ja bei
der Aufreinigung alle entfernt worden.

Ich weiß ,dass zu erklären ist irgendwie nicht so toll aber
vielleicht kann mir trotzdem jemand helfen :wink:

Was war eigentlich deine Frage?

Grüße,
Jochen

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Hallo,

Welche Untersuchungen müsste ich noch machen um deine
Ergebnise noch weiter zu belegen ??

Da weiß ich nicht genau, was du meinst. Kannst du das konkretisieren?

und was ist denn diese komische valin einbau in my mol/min ???
wieviel valin da jetzt eingebaut wird oder wie?

Ja, genau! „mol“ ist eine Stoffmenge oder Teilchenmenge und hat keine Einheit - es ist einfach eine Zahl, nämlich 6,022x1023. Diese Zahl ist riesig groß, es ist eine 6 mit 23 Nullen! Also: Ein Mol Valin sind eben 6,022x1023 Valin-Moleküle.

Nebenbei: Man kommt auf diese ‚komische‘ Zahl über das Atomgewicht. Die Definition leitet sich ab vom Kohlenstoff, der das 12-fache Atomgewicht des einfachsten Atoms, des Wasserstoffs wiegt (eigentlich hätte man Wasserstoff nehmen sollen, aber Kohlenstoff war praktischer in der Handhabung). 12 Gramm Kohlenstoff enthalten nun per Definition genau 1 Mol Kohlenstoff-Atome, und das sind eben 6,022x1023. So wiegt als 1 Mol Wasserstoff-Atome 1 Gramm.

Dieses „my mol“, auch µmol steht für Mikro-Mol, also millionstel Mol (so wie ein Mikro-Meter „µm“ ein millionstel Meter ist).

„mol/min“ ist seines Zeichens eine Rate: Mol pro Minute. Es meint in der gegebenen Aufgabe, wieviele Teilchen (Valin bzw. Cystein) pro Minute in die Peptidkette eingebaut werden.

Ein Wert von zB. 43 µmol/min bedeutet also, daß jede Minute 43 x 6,022x1017 Valin-Moleküle eingebaut werden. Nun wiegen 43 µmol Cystein 43 x 121.2µg = 5.21mg und 43 µmol Valin 43 x 117.1µg = 5.04mg. Cystein und Valin werden immer abwechselnd eingebaut, dh., im Protein ist nochmal die gleiche Menge Cystein eingebaut. So werden also jede Minute 5.04mg Valin und 5.21g Cystein eingebaut, das sind zusammen 10.25mg Aminosäuren pro Minute. Man kann also, wenn man die Molekulargewichte der Aminosäuren kennt, kann man die Angabe µmol/min auch in µg/min umrechnen. Jetzt kannst du zB. ausrechnen, wie lange du - unter gleichbleibend guten Bedingungen für die Reaktion - warten müßtest, um 1g Protein zu bekommen: 1 Stunde, 37 min und knapp 33 Sekunden. Wie gesagt, für eine konstante Einbaurate von 43 µmol/min.

Beim anderen Diagramm steht halt Cystein- Einbau my mol/min
dran und die Kurven sind ähnlich aber nicht gleich warum ???

Ich weiß nicht, wie unterschiedlich sie sind, aber sie sollten recht ähnlich sein, denn es ist zu erwarten, daß die Einbauraten für Valin und Cystein gleich sind, zumal die Codone UGU und GUG sich ja immer abwechseln.

Etwas anders könnte es sein, wenn du eine Poly-(UGU)-mRNA hast und dort den Cystein-Einbau mißt und das vergleichst mit einer Poly-(GUG)-mRNA, wo du den Valin-Einbau mißt. Hier könnte es Unterschiede geben.

Wieso hat Versuch 2 und 3 trotzdem eine Kurve obwohl quasi
keine Proteinsynthese vollzogen wird??

Dafür gibt es zwei mögliche Gründe: Zum einen mißt man immer etwas Radioaktivität (teils Hintergrundstrahlung teils Reste von radioaktiven Aminosäuren, die man nie (bzw. nur mit großem Aufwand) ganz 100%ig aus der Lösung entfernen kann). Zum anderen könnte es sein (nu in dem Versuch, wo mRNA zugegen ist), daß unter den Versuchsbedingungen von der Polymerase manchmal eine falsche tRNA akzeptiert wird, so daß man nach einiger Zeit tatsächlich geringe Mengen kurzer -radiaktiv markierter- Peptidketten bekommt.

Grüße,
Jochen