Hallo Bernhard,
Eine Kurzbeschreibung kann ich aus meiner Arbeit über PCR zitieren:
Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist es möglich, spezifische Sequenzbereiche aus geringsten Ausgangsmengen von Nukleinsäuren in vitro und zudem schnell zu amplifizieren, um sie so einer Analyse oder Weiterverarbeitung zugänglich zu machen. Das Grundprinzip der Polymerase-Kettenreaktion stellt sich wie folgt dar: Ein doppelsträngiges DNA-Molekül wird durch Hitzeeinwirkung aufgeschmolzen (denaturiert). Die Einzelstränge dienen in der Folge als Matrize für die enzymatisch katalysierte Polymerisation von Desoxyribonukleotiden, wodurch wieder doppelsträngige DNA-Moleküle entstehen. Die als Primer bezeichneten Oligodesoxyribonukleotide definieren dabei den zu kopierenden Sequenzabschnitt, indem sie an Orten komplementärer Sequenz mit der Ziel-DNA hybridisieren und als Starter für die Polymerisation dienen. Der Prozess exponentieller Produktbildung wird von verschiedenen Faktoren begrenzt. Im Laufe der PCR geht die Netto-Produktbildung daher schließlich auf Null zurück und die Gesamtmenge an PCR-Produkt erreicht einen Plateauwert. Die Ursachen dafür werden z. B. bei MORRISON & GANNON umfassend diskutiert. Erstmals beschrieben wurde ein Verfahren zur biochemischen Amplifikation von DNA in vitro bereits 1971 von KLEPPE et al. Die damals verfügbare KLENOW-Polymerase zur DNASynthese war nicht hitzestabil und musste nach jeder Denaturierung erneut dem Reaktionsansatz zugegeben werden. Dieser Aufwand stand einer weiten Verbreitung dieser Methode entgegen, bis MULLIS 1988 den genialen und durch seine Einfachheit bestechenden Einfall hatte, eine aus thermophilen Bakterien (Thermus aquaticus) isolierte DNA-Polymerase zu verwenden, welche den Denaturierungsprozess der DNA unbeschadet übersteht.
Vielleicht hilft das ja schonmal. Doch jetzt konkret zu deinen Fragen:
ich möchte gerne im Groben herausfinden, wie DNS ausgelesen
wird.
Ich bin mir nicht sicher, was du mit „auslesen“ meinst. Mit der PCR an sich kann man die Abfolge der Basen (also die genetische Information) nicht lesen, sindern eben nur vervielfältigen. Nichtsdestotrotz ist eine solche Vervielfältigung definierter Abschnitte der DNA (ach ja: DNA ist englisch für DNS, eben A cid statt S äure) Voraussetzung für das eigentliche „Auslesen der Basensequenz“, was man aber als „Sequenzierung“ bezeichnet. Ich denke aber, du willst wissen, wie die PCR funktioniert.
Nachdem, was ich bisher gelesen habe, ist das momentan
angewendete Verfahren PCR - „Polymerase Chain Reaction“. Ist
das immer noch der Fall?
Ja. PCR ist immer noch die Methode, um definierte Abschnitte der DNA zu vervielfältigen. Diese Verfielfältigung ist die Voraussetzung für sehr viele weitere Analysen oder Experimente, die man mit der DNA machen kann (zB. Sequenzieren).
Ich habe folgendes verstanden: Die DNA wird
vervielfältig, und unter Erwärmung an die 90°C wird die DNS
scheinbar gezogen und die Doppelhelix aufgespalten. Ist das
noch richtig?
Ja. Die PCR ist ein Temperaturgesteuerter Prozeß. Dieser Prozeß startet mit der DNA, die kopiert werden soll sowie einigen anderen Zutaten und endet mit zwei Kopien dieser DNA. Dieser Kopiervorgang läuft in drei Schritten:
- Aufschmelzen (denaturieren) der DNA-Doppelhelix in die beiden Einzelstränge. Das erfolgt bei hoher Temperatur (>90°C).
- Das Binden sehr kurzer, synthetisch hergestellter DNA-Stücke definierter Sequenz (die sog. „Primer“). Diese kurzen (ca. 20 Basen) langen Moleküle finden und binden die komplementäre Sequenz auf dem zu kopierenden DNA-Molekül. Diese sogenannte Hybridisierung erfolgt bei niedriger Temperatur (ca. 55°C).
- Die hybridisierten Primer werden von einem Enzym, der DNA-Polymerase, verlängert. Dabei werden die beiden Einzelstränge des ursprünglichen DNA-Moleküls - die hier jeweils als Matrize dienen - wieder zu zwei Doppelsträngen vervollständigt. Das passiert bei der Wohlfühltemperatur des Enzyms. Da ein Enzym aus thermophilen Bakterien verwendet wird, ist diese Temperatur recht hoch, so 60-80°C, meist 72°C.
Danach werden sogenannte Primers an die Basen der DNS
gebunden. Was sind denn Primers?
Wie schon gesagt, ein Primer ist ein kurzes Stück einzelsträngige DNA, synthetisch hergestellt, mit bekannter Basenabfolge.
Und was passiert dann, um die
DNS auszulesen?
Wie auch gesagt: Das Enzym DNA-Polymerase erkennt und bindet diese DNA-Primer-Hybride und beginnt, den Primer zu verlängern. Dazu bedient sich das Enzym der freien Desoxyribonukleosid-Triphosphaten (kurz dNTP’s, also dATP, dCTP, dGTP und dTTP). Welches davon als nächstes angehängt wird, entscheidet die korrespondierende Base in DNA-Strang (der ja als Matrize dient). Nur das zu dieser Base komplementäre dNTP kann sich anlagern und wird dann vom Enzym unter Abspaltung eines Pyrophosphat-Restes an die wachsende Kette angehängt (das Enzym katalysiert dabei die Bildung eine Phospho-Diesterbindung vom neuen dNTP zum 3’-OH der Desoxyribose der Kette). Dieser Vorgang wiederholt sich, bis das Ende des Matrizenstranges erreicht ist oder das Enzym abfliegt oder die Temperatur wieder erhöht wird.
Über Hilfe würde ich mich sehr freuen!
Hoffe, das hat nur etwas verwirrt und trotzdem geholfen. Jetzt kannst du ja nochmal präziser nachfragen.
Grüße,
Jochen
