Moin Stefan!
Jo… Konzentration einfach verdammt hoch… zählt halt im
Quadrat… Würde ich glatt mal vermuten.
Stichwort: Massenwirkungsgesetz.
Falls das Annealing so
leicht und unspezifisch klappt, würde man doch eher einen
Riesenschmier erwarten, weil ja dann auch viele andere
Nebenprodukte (durch Annealen an anderen DNA-Stellen)
entstehen müssten.
Ne, das stimmt so nicht. Man stelle sich vor, einer der Primer
bindet an eine bestimmte Sequenz unspezifisch halbwegs gut:
Dann kann Dieser Strang durch die taq komplementarisiert
werden in 3’-Richtung. Die taq ist jedoch …
Diese Erklärung ist zwar richtig, aber nicht die Antwort auf die Frage. Auch hier ist die richtige Antwort: Massenwirkungsgesetz. Aufgrund der sehr hohen Konzentrationen der Primer ist die Wahrscheinlichkeit, dass es innerhalb der ersten Zyklen zu einer Strangverlängerung nach unvollständiger Hybridisierung eines Primers (mit einem anderen Primer oder mit der cDNA/DNA) kommt, eben schon merkbar hoch. Kommt es zur Initiation der Elongation, dann rennt die Polymerase weiter - egal, wie gut der Primer hybridisiert war. Der so entstandene Strang gesellt sich zum Pool der DNA, die ab dem nächsten Zyklus für ein Fehlpriming (sowohl durch den „Hin-“ als auch durch den "Rück-"Primer !) zur Verfügung steht. Passiert das auch noch mal, dann haben wir einene Strang produziert, der anschließend wie das spezifische PCR-Produkt amplifiziert wird, weil sich an beiden Enden durch die dort eingebauten Primer die korrekten Primer-Bindesequenzen befinden. Ist dieses unspezifische Produkt deutlich länger, kann es sein, dass es doch nicht so gut amplifiziert wird wie das (kürzere) spezifische Produkt, eben wegen der von Dir schon genannten endlichen Prozessivität der Polymerase.
Ja, wenn es denn erstaml anfängt mit den Primern sind ja auch
ähnliche Reaktionen denkbar und außerdem werden dann ja auch
für die Primer komplementäre Sequenzen erzeugt, wenn ich mir
das nicht grad falsch vorvorstelle, weil die taq so kleine
Strecken abarbeiten kann. Dann begänne zumindest Teilweise
eine echte fast „zielgerichtete“, zumindest bevorzugte,
Amplifikation.
Wenn zwei Primer 3’-überlappend aneinander binden und die Polymerase die Einzelstrang-Überhänge auffüllt, entsteht dabei eine dsDNA mit PERFEKTEN Primerbindungsstellen. Das wird natürlich „spezifisch“ weiteramplifiziert, und zwar mit hoher Effizienz, weil die Produktlänge i.d.R. sehr kurz ist (~30-60 bp).
Dieses dann amplifizierte Produkt sieht im Agarosegel meist wie eine (dünne) Wolke aus, weil die Trennleistung des „normalen“ Agarosegels für so kurze Produkte nicht so gut ist. Natürlich können auch mehrere verschiedene sog. Primer-Dimere entstehen, deren Banden sich im Gel überlagern, die Wolke also noch weiter „verschmieren“.
Anhand des Gelbildes unterschätzt man übrigends gerne die Konzentration der gebildeten Dimere, weil ihre Länge so kurz ist (und pro Molekül weniger EtBr interkaliert) und weil die Banden im Gel nicht scharf sind.
Viele Grüße,
Jochen
Die letzten Worte heute vom Chef als er das Gelbild gesehen hat: „Ah, soein Mist, ich fasse es nicht. Ich muss mir nochmal was anderes überlegen und in medias res gehen.“