Hallo!
Was ist sensitiver, wenn in einer Zellpopulation vielleicht 5% der Zellen ein Gen expremieren? cDNA-PCR oder In Situ Hybridisierung? Vorausgesetzt beides wird vernünftig durchgeführt…
Kann man das so pauschal beantworten? Wohl eher die PCR oder? Aber wie sieht es mit einer schlechten PCR aus? Könnte die In Situ Hybridisierung da besser laufen?
(OK, In Situ Hybridisierung ist sehr aufwändig und man sollte sich schon sicher sein, was man da tut, das ist mir klar…)
VG, Stefan
Hallo!
Meine nicht experimentell gesicherte Antwort:
Die PCR ist sensitiver.
Prinzipiell kann man mit der PCR ein einzelnes Molekül nachweisen. Das klappt sogar völlig problemlos, wenn die Primer gut funktionieren.
Knackpunkt ist hier weniger die PCR als das, was davor kommt:
Bei der Isolation der RNA und bei der reversen Transkription (RT) hast Du Verluste. Die Verluste durch Isolation kann man durch eine in-situ-PCR praktisch eliminieren. Die Effizient der RT hängt empfindlich von allen möglichen Bedingungen ab. Hier wäre die Effizienz in einem Experiment für Deine Proben zu bestimmen. Dennoch glaube ich, dass bei einer one-step in-situ RT-PCR eine einzelne vorhandene Transkript-Kopie in mehr als 90% der Fälle nachweisen lassen sollte. Das dürfte immer noch empfindlicher sein als eine in-situ-Hybridisierung (wo du ja beim Waschen wieder einiges an Signal von in sehr wenigen Kopien vorliegenden Transkripten verlierst. Hier schätze(!) ich die Nachweisrate für einzelne Kopien auf 10%. Man korrigiere mich bitte, wenn ich grob daneben liegen sollte.
LG
Jochen
Stringenz der PCR?
Hallo Jochen!
Wie sieht es denn mit der Stringenz aus? Bei einer PCR, bei der unspezifischer Müll mitamplifiziert wird als starker Schmier und deine gesuchte Bande undeutlicher macht…
Da wäre eine In Situ Hybridisierung doch stringenter oder?
VG, Stefan
Hallo Stefan,
Die PCR ist so stringent wie die Primer (unter den gegebenen Reaktionsbedigungen), die in-situ-Hyb ist so stringent wie die Sonden (unter den gegebenen Hybridisierungsbedingungen).
Was soll ich da nu sagen?!
WENN eine PCR unspez. Müll mitamplifiziert, taugt sie sowieso nicht. Das müßtest du vergleichen mit einer Sonde, die auch an anderen Sequenzen (unspezifisch) hybridisiert. So what?
LG
Jochen