Wasser Gen Idee Diplomarbeit Analyse Primer Labor

Trobuleshooting Gelelektrophorese v. PCR-Produkten

Von: , Frage gestellt am Do, 12. Apr 2007

Hallo an alle Hilfwilligen,

ich brauche jedwede Hilfe von biologisch angehauchten Laboranten.
Ich mache gerade meine Diplomarbeit in einem molekularwissenschaftlichen Labor und analysiere dabei (bzw. sollte analysieren) die Expression eines bestimmten Gens mittels PCR. Ich hab also mRNA isoliert (Qiagen-Kit), cDNA geschrieben (Invitrogen-Kit) und das ganze mit den üblichen Reagenzien (Puffer, Taq, dNTPs, dH2O, Primer) zusammenpipettiert und in die PCR-Maschine gestellt (dasselbe Programm, das bei meinem Betreuer mit diesen Primern funktioniert).
Bei der Analyse auf einem Agarosegel kommt aber nichts Vernünftiges raus: Wenn ich mein eines bestimmtes Problemprimerpaar verwende, erhalte ich einen unglaublichen Schmier auf dem Gel, strahlend hell und so intensiv, dass in dieser Spur eventuell vorhandene Banden gar nicht mehr zu finden sind.
Ich habe alle Reagenzien ausgetauscht. Ich habe sogar neue Primer bestellt, weil's letztes Mal so aussah, als ob es an denen läge (der Mastermix ist bei den anderen Primerpaaren ja identisch bis eben auf diese Primer). Aber auch jetzt hab ich einen unwahrscheinlich strahlenden Schmier in jeder dieser Spuren - sowohl bei der Positiv- wie auch bei der Negativ- und sogar bei der Wasserkontrolle.

Hat jemand von euch irgendeine Idee, wie sowas zustande kommen könnte? Andere Wasserkontrollen mit anderen Primern sind völlig in Ordnung und der Primer funktioniert bei meinem Betreuer selbst auch wunderbar, er kriegt schöne, klare Banden.
Was ich schon überlegt habe: Neue Reagenzien, Pipettenspitzen mit Filter, andere Pipetten, neue Primer, ... alles brachte nix.

Das ist jetzt eine sehr lange Fehlerbeschreibung, danke an alle, die mit dem Lesen bis hierhin durchgehalten haben. Falls ihr irgendeine Idee habt, sagt doch bitte Bescheid, ich bin für jede Anregung wirklich dankbar - das hat mich bis jetzt vier Wochen Diplomarbeit gekostet und es scheint kein Ende in Sicht.

Habt vielen Dank,


Susanne

5 Antworten zu dieser Frage

1. Antwort von nach 25 Minuten 0 hilfreich

   Re: Trobuleshooting Gelelektrophorese v. PCR-Produ

   Tach,
   also wenn Du selbst in der Negativkontrolle mit Wasser nen Schmier
   kriegst, dann hast Du irgendwo ne deftige Kontamination.
   Neues DEPC Wasser ansetzen? Irgendwo bekommst Du zuviel DNA her.
   Vermutlich an einem der ersten Schritte.
   Mach doch mal von jedem Schritt eine PCR. Also mache Deine gesamte
   Geschichte durch und behalte in jedem Schritt eine Probe für die PCR.
   Dann kannst Du genau gucken, in welchem der vielen einzelnen
   Reaktionen Du was falsch machst. Eine nach der mRNA Isolation, eine
   Probe nach dem cDNA schreiben etc....
   
   CU
   Lalle
   

   • Antwort von nach 29 Minuten 0 hilfreich

     Re^2: Trobuleshooting Gelelektrophorese v. PCR-Pro

     Hi Lalle,
     
     danke für die Idee! also wenn Du selbst in der Negativkontrolle mit Wasser nen
     Schmier
     kriegst, dann hast Du irgendwo ne deftige Kontamination.
     ... aber eine, die sich ausschließlich dann auswirkt, wenn das eine Primerpaar drin ist - dieselbe DNA mit quasi demselben Mastermix, nur andere Primer, gibt Banden. Das ist es ja, was ich nicht verstehe *seufzt*. Irgendwo bekommst Du zuviel DNA
     her.
     Vermutlich an einem der ersten Schritte.
     Mach doch mal von jedem Schritt eine PCR. Also mache Deine
     gesamte
     Geschichte durch und behalte in jedem Schritt eine Probe für
     die PCR.
     Dann kannst Du genau gucken, in welchem der vielen einzelnen
     Reaktionen Du was falsch machst. Eine nach der mRNA Isolation,
     eine
     Probe nach dem cDNA schreiben etc....
     Werd ich mal versuchen, das ist es auf jeden Fall wert, danke dir vielmals! Falls ich je rausfinde, was das ist, schreib ich's hier.
     
     Viele Grüße,
     
     
     Susanne, weiter auf des Rätsels Spuren
     

     • Antwort von nach 7 Stunden 0 hilfreich

       Re^3: Trobuleshooting Gelelektrophorese v. PCR-Pro

       Hi,
       ... aber eine, die sich ausschließlich dann auswirkt, wenn das
       eine Primerpaar drin ist - dieselbe DNA mit quasi demselben
       Mastermix, nur andere Primer, gibt Banden. Das ist es ja, was
       ich nicht verstehe *seufzt*.
       Du sagtest Dein Betreuer hätte mit "diesen Primern" gute Ergebnisse gehabt. Dieselben oder diegleichen?
       Wenn neue (gleiche) bestellt wurden kann da auch mal was schief gehen, oder sie sind uralt und nicht gut gelagert??.
       Hast Du keine positiv Kontrolle mit der Du auch diese Primer abcheckst?
       
       Wir haben unsere 100µM stocks stets bei -20°C und div Aliquots [10µM] zum Gebrauch. Im Zweifelsfall Aliquot wechseln oder neue bestellen (kostet echt nicht die Welt).
       Gruß
       M.
       

       • Antwort von nach 5 Tagen 1 hilfreich

         Re^4: Trobuleshooting Gelelektrophorese v. PCR-Pro

         Hi, ... aber eine, die sich ausschließlich dann auswirkt, wenn das
         eine Primerpaar drin ist - dieselbe DNA mit quasi demselben
         Mastermix, nur andere Primer, gibt Banden. Das ist es ja, was
         ich nicht verstehe *seufzt*.
         ... dann kann es ja nur an den Primern liegen. Ich würde nicht darauf vertrauen, dass das vorher immer gut funktioniert hat. Das hat man mir oft erzählt ;-). Ich würde neue Primer designen um einen andere Spezifität hinzubekommen. Du sagtest Dein Betreuer hätte mit "diesen Primern" gute
         Ergebnisse gehabt.
         Ich weiß bei der PCR kann man verrückt werden. Zur Not hilftz vielleicht auch einfach mal jemanden anders die machen zu lassen, mit frischen Primern und vielleicht sogar in einem anderen Raum... Vielleicht den erfolgreichen Betreuer einfach selber?
         
         Gruß
         Juhe
         

2. Antwort von nach 12 Stunden 1 hilfreich

   Re: Trobuleshooting Gelelektrophorese v. PCR-Produ

   Hallo,
   
   mopedhexle hat ja einen guten Tipp gegeben:
   
   schau dir die Primer nochmal an!
   
   Sind es sehr alte Stocks... mal neue bestellen.
   Sind sie neu... nachlesen - Base für Base - ob die Sequenz stimmt.
   
   Was sie zur Positiv-Kontrolle gesagt hat, ist auch wichtig. Du kannst auch ein altes PCR-Produkt als Positiv-Kontrolle nehmen (muddu aber verdünnen, gelle)
   
   Außerdem:
   
   Kontrollieren, ob das PCR-Protokoll in der Maschine stimmt. Manchmal ändert ein Spaßvogel mal ungefragt ein Protokoll und sagt nix...
   
   Naja, und dann NOCHMAL alles checken, insbesondere die Konzentrationen der Primer-Arbeitslösungen (weil alles andere ja zu funktionieren scheint). Da wird auch gerne mal ein Faktor 10 daneben gelegen...
   
   Der Schmier spricht für eine unspezifische Amplifikation. Gründe dafür kann zu viel Mg, zu viel Primer, zu niedrige Tm und auch zu viele Zyklen sein!
   
   Also vielleicht auch mal weniger Zyklen probieren (35 sind idR genug; wenn mal was nicht klappt, ist man ja schnell versucht, 40 oder gar 45 Zyklen zu machen...).
   
   LG
   Jochen
   

Keine passende Antwort gefunden? Jetzt eigene Frage stellen!