Agarosegele und PA-Gele: Ohmsche Widerstände?

Wissenschaft Biologie
1

Hallo!

Wenn ich im Labor stehe und meine Proteine oder Kernsäuren in einem elektrischen Feld auftrenne, dauert mir das immer zu lange. Natürlich hilft es, die Spannung hochzudrehen. Das ist natürlich immer riskant, weil die Banden dadurch etwas schlechter werden können.
Trotzdem habe ich mich gefragt, wieviel es bringt, die Spannung aufzudrehen. Bisher habe ich keine Antwort bekommen und sowas in einer Vorlesung zu stellen, wird immer als Schleimerfrage gewertet.
Also frage ich Euch :wink: Verhälten sich PA-Gele und Agarosegele wie ohmsche Widerstände gegenüber Kernsäuren und Proteinen? (Eigentlich interessiert mich weniger, wie stark die Elektrolyse ist, sondern eher der Stromfluss der Kernsäuren und Proteine, sprich, deren Wandergeschwindigkeit.)

Viele Grüße, Stefan

2

Hallo Stefan,

zuerst mal:
Ich habe seit Jahrzehnten keine Eletrophorese mehr gemacht und zitiere aus der Erinnerung!

Mir wurde das damals so erklärt, daß bei zu hohen Strömen/Spannungen zum einen die Banden unscharf werden und zum zweiten die Temperatur zu hoch werden kann.
Wenn man dann von außen kühlt, kriegt man einen Temperaturgradienten von innen nach außen, was zu Bandenverschiebungen/verschmierungen führen kann.

Irgendwann setzt wohl auch Elektrolyse ein, was dann alles in den Schrott fährt.

Gandalf

3

hallo stefan,

mein hintergrund ist - s. mein nick - nicht selbst durchgeführte elektrophoresen; aber als materialwiss. hatte ich mal sehr viel mit den el. eigenschaften von hochporösem zeugs zu tun - ein weites feld! :wink:

Verhälten sich PA-Gele und Agarosegele
wie ohmsche Widerstände gegenüber Kernsäuren und Proteinen?

den ersten teil der frage verstehe ich. ja, so lange die spannung nicht zu einer generierung von ladungsträgern führt sondern nur vorhandene ladungsträger des gels ‚bewegt‘ kannst du davon aus gehen, dass sich strom / spannung linear verhalten.

was aber meinst du mit „gegenüber Kernsäuren und Proteinen“?

so weit ich weiss (nicht sehr weit) dient bei dir das gel ja nur zur selektiven sterischen hinderung (das war die beste fremdwortkombi die mir dazu einfiel…) bei der teilchenbewegung, meint die porenradienverteilung des gels führt dazu, dass unterschiedlich grosse DNA-stränge bzw. allgemein ‚teilchen‘ unterschiedlich schnell wandern.

(Eigentlich interessiert mich weniger, wie stark die
Elektrolyse ist, sondern eher der Stromfluss der Kernsäuren
und Proteine, sprich, deren Wandergeschwindigkeit.)

…die wandergeschwindigkeit ist im gleichgewicht (= ohne beschleunigung) prop. dem angelegten el. feld und der ladung und umgekehrt prop. dem reibungskoeff.
letzterer ist aber schon ein hochkomplexer kamerad, weil es da neben der teilchen/porenform, der viskosität, der hydratationshülle der gel. teilchen etc. pp. sehr viele etc. pp.-s zu beachten gibt.
wenn du dann noch bedenkst, dass du mit der höheren spanung eine höhere temperatur, damit höhere anzahl von ladungsträgern, mobiliäte etc. produzierst kannst du eigtl. froh sein, die frage noch nicht in der vorlesung gestellt zu haben…diese vorgänge wären selbst thema für eine vorlesung!

in diesen bereichen, wie sonst auch in den mat.wiss., kommt die theorie immer erst hinterher, zuerst wird geguckt was passiert :wink:

viel glück dabei…

stefan

4

Hallo!

Danke schonmal.
Nur kurz soviel: Man braucht schon entsprechende Puffer in entsprechender Konzentration zumindest bei DNA Agarosegelelektrophoresen. Ich weiß nicht, aber ich habe glaub ich gehört, die Puffer würden die DNA „antreiben“ bzw. anstoßen. Kannst Du Dir das vorstellen?

Viele Grüße, Stefan

5

hallo stefan

also, wenn ich richtig liege, dann enthält ein puffer doch pos. ODER neg. ionen. dann kann ich mir vorstellen, wie die ionenwanderung, hervorgerufen durch das e-feld insgesamt eine strömung bewirkt, die die gelösten dna-stücke mitnimmt. letztere werde dann, wie gehabt, durch die poren unterschiedlich stark behindert.

stefan

6

Hallo Stefan,
natürlich ist ein Gel ein ohmscher Widerstand. Je länger das Gel ist, desto grössere Spannung musst Du anlegen um die gleiche Wandergeschwindigkeit zu bekommen.
(für den anderen Stefan: natürlich sind Nukleinsäuren und Proteine gelanden und wandern daher im Gel).
Je höher die Spannung desto schneller die Wanderung.
Allerdings ist auch die Verzerrung des Feldes zwischen den beiden Elektroden grösser, je grösser die angelegte Spannung ist. Das führt zu diesen smiling-Gelen.
Auch bringt eine zu hohe Spannung (oder eher Stromdichte) eine Erwärmung mit sich (die auch nicht gleichmässig sein muss), die im schlimmsten Fall das Gel zum schmoren bringen kann.

bester Gruss
yps

ps: in welchem Semester bist Du denn, wenn eine Frage in der Vorlesung als schleimermässig gewertet wird??

7

Hallo yps:

Meine Frage war eigentlich, ob die Geschwindigkeit der gerichteten Bewegung der Proteine/Kernsäuren während der Elektrophorese proportional zur Stärke des E-Feldes ist. (Ich gehe jetzt mal davon aus, dass in einer Elektrophorese ein nahezu homogenes E-Feld herrscht. Möglicherweise täusche ich mich da ja auch.)

Weißt DU etwas über die Aufgabe der Puffer?

ps: in welchem Semester bist Du denn, wenn eine Frage in der
Vorlesung als schleimermässig gewertet wird??

Im 4. Semester. Aber viele Vorlesungen sind zusammen mit den Medizinern. Und da irgendwo Interesse an wissenschaftlichen Hintergründen zu bekunden „schickt sich nicht“ :wink:
Außerdem stelle ich sowieso schon so viele Fragen, dass ich eh schon schief angesehen werde. Aber ich vermute eh, die Frage wäre so speziell und experimentlastig, dass die Profs das vielleicht eher nicht wissen sondern die Postdocs und anderen wissenschaftlichen Mitarbeiter, die in den Labors die Arbeit machen. Deshalb habe ich dann auch hier gefragt.

Grüße, Stefan

8

wozu Puffer?
Hallo Stefan,

Meine Frage war eigentlich, ob die Geschwindigkeit der
gerichteten Bewegung der Proteine/Kernsäuren während der
Elektrophorese proportional zur Stärke des E-Feldes ist. (Ich
gehe jetzt mal davon aus, dass in einer Elektrophorese ein
nahezu homogenes E-Feld herrscht. Möglicherweise täusche ich
mich da ja auch.)

nach meiner Erfahrung ist es so, dass Proteine im SDS-PAGE und DNA/RNA im TBE-gepuffereten Agarosegel schneller laufen, je stärker die Spannung/Strom ist. Das ist natürlich tirvial. Ebenfalls ist es einsichtig, dass wegen der Siebwirkung der Gelmatrix kleine Fragemnte schneller als grössere im Gel wandern. ABER ob eine lineare Proportionalität der Wandergeschwindigkeit zur angelegten Spannung oder eine was-auch-immer-für-eine Abhängigkeit vorliegt, weiss ich nicht. Könnte aber eine interessante Frage sein, wenn ich jetzt überblicken könnte, was es für Konsequenzen hätte, wenn es z.b eine quadratische Abhängigkeit gäbe. IMHO bringt es aber nichts, wenn man dies wüsste. Mir reichte immer: Je mehr Spannung, desto schneller laufen die Moleküle.

Weißt DU etwas über die Aufgabe der Puffer?

DAS ist eine wirklich interessante Frage. Bei DNA-Gelen ist das noch recht einfach: es braucht Ionen, dass ein Strom fliesst und der pH-Wert soll auch konstant bleiben.
Aber beim Tris-Glycin-Puffer und Trenn- und Sammel-Gel der SDS-PAGE ist das schon sehr kompliziert! Sorry, ich kireg es nicht mehr zusammen. Gibt es da nichts im WWW dazu?

ps: in welchem Semester bist Du denn, wenn eine Frage in der
Vorlesung als schleimermässig gewertet wird??

Im 4. Semester. Aber viele Vorlesungen sind zusammen mit den
Medizinern. Und da irgendwo Interesse an wissenschaftlichen
Hintergründen zu bekunden „schickt sich nicht“ :wink:

das wird sich noch ändern… In eine paar Semesten, „darf“ man schon mehr fragen, ohne als Streber angesehen zu werden. Pass mal auf.
was genau studierst Du denn? Humanbiologie??

take care
yps

9

Hallo!

es braucht Ionen, dass ein Strom

fliesst und der pH-Wert soll auch konstant bleiben.

Warum muss denn eigentlich ein Strom fließen? Wirkt das Gels sonst als stärkeres Dielektrikum und das E-Feld wird geschwächt oder was? Was interessiert mich der Strom?

Aber beim Tris-Glycin-Puffer und Trenn- und Sammel-Gel der
SDS-PAGE ist das schon sehr kompliziert! Sorry, ich kireg es
nicht mehr zusammen. Gibt es da nichts im WWW dazu?

Ah, das werde ich vielleicht im Experimentator nachlesen können, Sorry.

was genau studierst Du denn? Humanbiologie??

Molekulare Biomedizin

Viele Grüße, Stefan

10

hallo yps,

nachdem du mich ja dezidiert in deine antwort miteinschliesst - und ich immer froh bin über fachgrenzen hinweg zu dilettieren :wink: …:

natürlich ist ein Gel ein ohmscher Widerstand.

vorsicht, das ist nicht so natürlich! ohmsch heisst ja, linearer & konstanter zusammenhang von strom und spannung.

ich vermute, dass innerhalb des gels der ladungstransport extrem nicht-ohmsch ist; erst die statistik macht daraus in sehr engen grenzen ein ohmsches verhalten wenn man ein gel insgesamt betrachtet.

Auch bringt eine zu hohe Spannung (oder eher Stromdichte) eine
Erwärmung mit sich (die auch nicht gleichmässig sein muss),
die im schlimmsten Fall das Gel zum schmoren bringen kann.

siehste ! :wink: …inhomogen! sonst tät nix durchbrechen…

so long,
stefan

11

hallo ihr,

kennt den jemand wirklich die innere struktur von euren gelen, also zb. die porenradienverteilung, ofl.struktur (zB. dipolar etc.), gibt es sog. dead ends (sackgassen), 0-dim-poren (also geschlossene, daher nicht zugängliche) und so weiter.
gele sind sagte ich schon - oder ? - ein weites feld. aber sehr spannend; ich könnte mir vorstellen, dass darüber tatsächlich noch niemand im detail geforscht hat sondern diese technik einfach als gegeben so hingenommen wird. gerade deswegen würde ich da dran bleiben, stefan!

Warum muss denn eigentlich ein Strom fließen?
Was interessiert mich der Strom?

naja, du brauchst einen auslöser für eine wanderungsbewegung der dna-s, proteine etc. in deiner gel-matrix. klar, du könntest auch den job einfach der schwerkraft und dem konz.-gradient (a la osmotischer druck) überlassen, das dauert nur sehr sehr lange und ausser physikern hat in den wissenschaften ja niemand mehr zeit :wink:

mir ist noch nicht ganz klar: es hat in der flüssigen phase im gel geladene teilchen UND das, was ihr euch eigtl. angucken wollt ist auch geladen?
beides bewegt die dna-s, proteine, beides ist aber identisch mit ‚stromfluss‘.

Wirkt das Gels
sonst als stärkeres Dielektrikum und das E-Feld wird
geschwächt oder was?

hm, da kommts auf das gel an. dieelektrikum ist ja erst mal sowieso alles.
mmh, rein als gedankenexperiment, wenn du die ganze flüssigkeit aus dem gel entnimmst (auch deine dna-s und etc.), dann bleibt ein luft/gasgefülltes gel, ein aerogel übrig. die nicht-feste phase ist so el. ganz sicher - weitestgehend - neutral. der festkörperanteil hat, auch klar, die eigenschaften, die ein block (ohne poren) des betreffenden materials auch hätte, was leitfähigkeit, dk, also komplexer widerstand betrifft. vorsicht: die eigenschaften des bulk-matrials sind nur ausgangspunkt für die bestimmung derjenigen des gels. da gibts div. theoretische verfahen um das für div. gel-morphologien zu machen.

bevor ich völlig den faden verliere: je nach der struktur des gels und der el. eigenschaften kann es ganz klar lokal zb. das e-feld so verstärken, dass es zum durchbruch kommt, können zwei gelwände so gegenüber liegen, dass man sie als plattenkondensator betrachten kann etc. pp.

Molekulare Biomedizin

cool…hast du auf arte die serie „regenetics“ gesehen?

stefan

12

Hallo!

kennt den jemand wirklich die innere struktur von euren gelen,
also zb. die porenradienverteilung, ofl.struktur (zB. dipolar
etc.), gibt es sog. dead ends (sackgassen), 0-dim-poren (also
geschlossene, daher nicht zugängliche) und so weiter.
gele sind sagte ich schon - oder ? - ein weites feld. aber
sehr spannend; ich könnte mir vorstellen, dass darüber
tatsächlich noch niemand im detail geforscht hat sondern diese
technik einfach als gegeben so hingenommen wird. gerade
deswegen würde ich da dran bleiben, stefan!

Ja, ich versuch mal, jemanden zu fragen.

Warum muss denn eigentlich ein Strom fließen?
Was interessiert mich der Strom?

naja, du brauchst einen auslöser für eine wanderungsbewegung
der dna-s, proteine etc. in deiner gel-matrix. klar, du
könntest auch den job einfach der schwerkraft und dem
konz.-gradient (a la osmotischer druck) überlassen, das dauert
nur sehr sehr lange und ausser physikern hat in den
wissenschaften ja niemand mehr zeit :wink:

Ne, ne, das meine ich anders. Weshalb reicht es nicht einfach, die Spannung anzulegen und die DNA als einzige ionisierbare Substanz drin zu haben?

mir ist noch nicht ganz klar: es hat in der flüssigen phase im
gel geladene teilchen UND das, was ihr euch eigtl. angucken
wollt ist auch geladen?

Ja, die Puffer sind geladen und die Proteine und die DNA sind beide negativ geladen. RNA im übrigen auch…

beides bewegt die dna-s, proteine, beides ist aber identisch
mit ‚stromfluss‘.

Ja, ich bin ja nicht bescheuert. Aber ob ich das Gel mit DNA „belade“ oder es ohne DNA laufen lasse, das macht für die Größe des Stromflusses keinen relevanten Unterschied.

Vielleicht will man in der Trennkammer nur Bewegung der DNA/Proteine, aber keine echte Ladungstrennung. Vielleicht also etwa vergleichbar mit einer galvanischen Zelle, über deren Diaphragma Ladungsträger ausgetauscht werden.

Molekulare Biomedizin

cool…hast du auf arte die serie „regenetics“ gesehen?

Ähhh, ich habe keinen Fernseher. Auch wenn das die GEZ nicht glauben mag. Was kam denn da drin vor?

Grüße, Stefan

13

hallo stefan,

ja, als studi hatte ich auch keinen TV, irgendwann hat dann eine -inwzischen- ex einen angeschleppt und der blieb kleben :wink:

die serie hiess regenesis, sorry, den titel hatte ich falsch erinnert. war aber extrem spannend:
http://www.arte.tv/de/film/Regenesis/1387738.html

Ne, ne, das meine ich anders. Weshalb reicht es nicht einfach,
die Spannung anzulegen und die DNA als einzige ionisierbare
Substanz drin zu haben?

ich vermute, dass alle dna-teilstränge die gleiche ladung haben, sich also nur durch ihre länge / grösse unterscheiden?

…letztlich willst du die dinger ja ‚filtern‘ und das erreichst du nur durch die selektive behinderung, so dass teilstränge entsprechend ihrer grösse unterschiedlich weit wandern. wären sie alle in einer suppe würdest du spanung anlegen und ‚sofort‘ wären ALLE an der kathode bzw. anode…

Ja, die Puffer sind geladen und die Proteine und die DNA sind
beide negativ geladen. RNA im übrigen auch…

gleich grosse ladung? also alle entweder einfach oder doppelt etc. geladen?

Vielleicht will man in der Trennkammer nur Bewegung der
DNA/Proteine, aber keine echte Ladungstrennung. Vielleicht
also etwa vergleichbar mit einer galvanischen Zelle, über
deren Diaphragma Ladungsträger ausgetauscht werden.

ja, damit hast du recht, wenn ich dich und das prinzip richtig verstehe. stromfluss heisst ja nicht notwendigerweise die komplette strecke von anode zur kathode, es ist ben auch die teilstrecke die für unterschiedlich grosse dna-fragmente unterschiedlich lang ist.

so long,

stefan

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Hallo Stefan,

sind jetzt alle wesentlichen Aspekte Deiner Frage geklärt, oder soll ich in den Tiefen meiner (alten) Unterlagen noch was suchen.

Aber über die Bewegung von DNA-Moleküen in einem Agarosegel ist schon einiges bekannt. Dazu gibt es auch schon mathematische Modelle…
BTW: hast Duschonwas von Pulsed-Field-Elektophorese gehört? Denn es ist nicht immer so, dass die kleinsten DNA-Fragemnte am schnellsten wandern.

bester Gruss vom Hochrhein
yps