Also wenn Du jetzt erwartest, dass ich ganze Lehrbuecher fuer Dich abtippe, dann muss ich Dich leider enttaeuschen. Daher werde ich jetzt den Test nur kurz erklaeren, wen Du es spezifischer wissen willst musst Du halt nochmal fragen.
Also ELISA ist die Abkuerzung fuer E nzyme- l inked I mmuno s orband a ssay. Entstanden ist der ELISA aus dem RIA, dem R adio i mmuno a ssay. Dabei wurden radioaktiv markierte Antikoerper verwendet, aber da ja heute jeder gleich aufschreit bei dem Wort „radioaktiv“ verwendet man heutzutage den ELISA bei dem die radioaktive Markierung durch ein Enzym ersetz wurde.
Das Prinzip des ELISA ist aehnlich wie beim Western Blot. Ein spezifischer Antikoerper gegen das zu bestimmende Antigen wird mit einem Enzym gebunden. Der so markierte Antikoerper bindet an das Antigen. Die Antikoerper, die nicht an ein Antigen gebunden haben werden in einem Waschschritt entfernt und das Substrat (die Substanz, mit der das Enzym reagiert) wird hinzugegeben. Je mehr Substrat umgesetz wurde, umso mehr Antikoerper haben gebunden und umso mehr Antigen war also vorhanden. Um quantitative Angaben machen zu koennen, muss eine Kalibration mit bekannten Antigenkonzentrationen erfolgen.
Um die Enzymreaktion moeglichst einfach nachweisen zu koenne bevorzugt man Enzyme und Substrate, die bei der Reaktion zu einem Farbumschlag fuehren und daher photometrisch nachgewiesen werden koennen. Die am haeufigsten benutzten Enzyme sind die Meerettich-Peroxidase (horse radish peroxidase) und die Alkalische Phosphatase.
In der praktischen Durchfuehrung gibt es verschiedene Moeglichkeiten des ELISA:
- kompetitive Methode
- Sandwich-Methode
- indirekte Methode
1.) Kompetitive Methode:
Der Antikoereper wird auf einem Traeger (Cellulose, Polystyrol …) gebunden. Die nicht mit Antikoerpern bedeckte Traegeroberflaeche wird geblockt, zum Beispiel mit Rinderserum-Albumin, um eine unspezifische Bindung des Antigens an der Oberflaeche zu vermeiden.
Nun wird die unbekannte Menge des zu bestimmenden Antigens und eine bekannte Menge Antigen, an dem das Enzym haengt, hinzugegeben. Als Kontrolle werden in einem weiteren Versuch nur das markierte Antigen verwendet bzw. man hat an die feste Phase keinen Antikoerper gebunden. Man erhaelt so den 0 und 100% Wert und kann die Menge des Antigens bestimmen. Die Bindung des Enzyms an das Antigen muss jedoch fuer jedes zu bestimmende Antigen aufs neue durchgefuehrt werden, daher wird die kompetitive Methode nur in Spezialfaellen eingesetzt.
2.) Sandwich-Methode
Wie auch bei der kompetitiven Methode wird der spezifische Antikoerper an einer festen Phase absorbiert. Dann wird die unbekannte Menge Antigen hinzugegeben und nicht gebundenes Antigen durch Waschen entfernt. In einem zweiten Reaktionsschritt wird nun ein Antikoerper gegen das Antigen hinzugegeben, der mit einem Enzym markiert ist. Dieser markierte Antikoerper bindet nun an die Antigene, die bereits von dem an der Festphase absorbierten Antikoerper gebunden sind. Durch einen weiteren Waschschritt werden die ungebundenen Antikoerper entfernt und zum Schluss das Substrat hinzugesetzt.
Die Sandwich-Methode wird zum Beispiel angewand um in Blutproben Krankheitserreger, Hormone oder aehnliches nachzuweisen bzw. in der Molekularbiologie als einfacher Test auf ein zu isolierendes Protein. Ein bekanntes Beispiel dieser Methode ist der Schwangerschafts-Teststreifen.
3.) indirekte Methode:
Sie dient nicht zum Nachweis von Antigenen, sondern zu Bestimmung des Antikoerper-Titers gegen ein vorgegebenes Antigen. Hier wird nicht der Antikoerper sondern das Antigen an die Festphase gebunden. Die Probe mit dem zu bestimmenden Antikoerper-Titer wird nun hinzugegeben und die nicht gebundenden Teile durch Waschen entfernt. Anschliessend wird ein unspezifischer Antikoerper (zum Beispiel ein aus Schafen oder Ratten isolierter Antikoerper gegen menschliche Proteine), der mit einem Enzym verbunden ist, hinzugegeben. Dieser zweite Antikoerper reagiert nun mit den gebundenen Antikoerpern aus der Probe. Nicht gebundende Antikoerper werden durch Waschen entfernt und das Substrat hinzugesetzt.
Der indirekte ELISA wird eingesetzt, um Viruserkrankungen (Aids, Hepatitis, Roeteln …), bakterielle oder Pilzinfektionen bzw. Parasitenbefall nachzuweisen.
Jeder Antikoerper reagiert nicht nur mit seinem spezifischen Antigen sondern leider auch unspezifisch mit anderen Proteinen, auch die Enzymreaktion ist nicht 100% spezifisch, so kann eine Umsetzung des Substrates zum Beispiel auch durch einen Bestandteil der Probe erfolgen. Daher ist jedem immunologisch positiven Befund zunaechst einmal Skepsis entgegenzubringen. Da der ELISA jedoch gut automatisierbar ist eignet er sich gut fuer Routineuntersuchungen. Im Falle eines unklaren positiven Befundes kann der Western Blot dann als spezifischere Massnahme durchgefuehrt werden, um den ELISA-Befund zu stuetzen. Da ein Western-Blot jedoch groesstenteils Handarbeit ist und auch eine gewisse Zeit dauert eignet er sich nicht als Routine-Verfahren.
So, ich hoffe, dass das jetzt erst einmal reicht, ansonsten nochmal spezifischer nachfragen.
Schoenen Feierabend.
Joern
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Ich glaub nicht, dass ich das auf Englisch formulieren könnte…