Ich habe nun mehrfach cDNA hergestellt und folgende Beobachtung gemacht: Eine PCR bei der diese cDNAs eingesetzt wurden funktionieren an einem Tag. An einem anderen aber unter identischen Bedingungen überhaupt nicht. Was könnte davor der Grund sein?
Hallo !
Was mag den eine PCR wohl sein ??
(?)
MfG
Matthias
PCR=Polymerase Chain Reaction
Ist die wichtigste Methode zur Vervielfältigung von DNA
Ich habe nun mehrfach cDNA hergestellt und folgende
Beobachtung gemacht: Eine PCR bei der diese cDNAs eingesetzt
wurden funktionieren an einem Tag. An einem anderen aber unter
identischen Bedingungen überhaupt nicht. Was könnte davor der
Grund sein?
Hallo Werner,
ich habe in den letzten Jahren hunderttausende von PCRs gemacht und musste dabei immer wieder feststellen,dass man manchmal einfach keine Gründe findet-100 mal hats funktioniert, diesmal nicht-PCR ist manchmal einfach Voodoo.
Allerdings nimmt die Qualität der Primer bei häufigem Auftauen und wieder einfrieren ab-das kann auch mal ein Grund sein-oder bei der Herstellung der cDNA war irgendwas nicht ok-ist aber auch meistens schwer rauszufinden.
Wir haben auch schon Beschwörungsformeln gemurmelt:smile:
Gruß Tanja „diejetztPCRsansetztengeht“
oder auf deutsch: Polymerase-Kettenreaktion.
Heute eine der wichtigsten Methoden in den Biowissenschaften. Sie ist die grundlegende Methode für Sequenzierungen (Human Genome Project, der genetische Fingerabdruck, molekulare Tumordiagostik, Lebensmittelkontrolle, usw, usw).
In einem zyklischen Prozeß wird ein bestimmter Abschnitt der Erbinformation (DNA) exponentiell vervielfältigt (zyklisch verdoppelt, so wie in einer sich teilenden Zellpopulation). Welches Stück dabei vervielfältigt werden soll, bestimmen kurze, heutzutage synthetisch hergestellte Oligonukleotide, die sog. Primer.
Die DNA ist doppelsträngig; die besteht aus zwei Ketten, die eineander komplementär sind (sich also wie Matrize und Patrize zueinander verhalten). Dieser Doppelstrang wird aufgeschmolzen in die beiden Einzelstränge. Dort finden die Primer ihre komplementäre (passende) Sequenz und werden dann von einem Enzym, der Polymerase, verlängert, so daß je eine komplementäre Kopie der Zielsequenz entsteht. Aus einem ursprünglichem Doppelstrang sind nun zwei identische Doppelstränge geworden. Für eine weitere Verdopplung im nächsten Zyklus muß man die beiden komplementären Stränge wieder voneinander trennen (denaturieren), damit die Primer wieder binden können usw. Dazu kocht man die DNA (bei ca. 95°C). Leider hält das kein „normales“ Enzym aus. Das merkt man ja, wenn man Eier oder Fleisch kocht, die dann eben nicht mehr so aussehen wie vorher.
1988 präsentierte eine Gruppe um Mullis (den Erfinder der PCR, dafür bekam er einen Nobelpreis) in der Fachzeitschrift Science die Idee, eine Polymerase aus einem thermostabilen Organismus zu verwenden, die eben durch das Erhitzen auf 95°C keinen Schaden nimmt. Somit brauchte man nach jeden Zyklus nicht erneut Enzym zugeben und der Prozeß konnte automatisiert werden.
Zitat:
Saiki, R. K., Gelfand, D.H., Stoffel, S.J., Higuchi, R., Horn, G.T., Mullis, K.B., Erlich, H.A. (1988): Primer directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 238: 487-491