Ich versuche schon seit geraumer Zeit einige Lücken in meinen Projekten zu schließen - mittels PCR.
Dazu verwende ich die Ready-to-Go PCR-Beads von Amersham. Nun bekomme ich aber mehrere Fragmente und weiß eben nicht welches das richtige ist.
Dann habe ich das ganze ohne Perlen versucht, d.h. ich habe die nötigen Sachen selbst zusammen gegeben. Aber auch da habe ich keine besseren Ergebnisse erziehlt.
Kann mir jemand mal einen Tip geben, wie man dieses Problem mit den vielen Fragmenten eventuell lösen könnte?
(es würde ja schon reichen, wenn’s nur noch 2 oder3 Banden wären)
Diese Projekte und gerade die Lücken sind in sehr Alu-reichen Regionen.
Kann mir jemand mal einen Tip geben, wie man dieses Problem
mit den vielen Fragmenten eventuell lösen könnte?
(es würde ja schon reichen, wenn’s nur noch 2 oder3 Banden
wären)
niedrigere Temperatur ? Bist Du schon in Bereichen, wo deine Polymerase permanent aktiv ist ?
Leider kenne ich das Kit nicht…
Diese Projekte und gerade die Lücken sind in sehr Alu-reichen
Regionen.
Wies aussieht, ist die reaktion nicht so spezifisch, wie du wünschst. das kann verschiedene Gründe haben.
Sind die Primer ok, haben sie also (nach Möglichkeit im gesamten Genom) keine false-priming sites ?
Enthält das PCR-Produkt repetetive Elemente und wie weit liegen die Banden auseinander ? Wenn’s passt, kann es sich um Slippage-Produke handeln.
Du könntest das Anneling allgemein stringenter machen, indem du die Mg-Konz verringerst und/oder die Annealing-Temp erhöhst und/oder DMSO oder Spermin zugibst.
Ich hatte auch schon mal Erfolg mit einer Touch-Down PCR: Fange 10K über der optimalen Annealing-Temp an und verringere diese in den ersten 10 Zaklen um je 1K.