Re: Aus mol. Pilzansammlung untersch. Pilze erkennen

Hallo Joyner,

Konnte leider nicht früher antworten. Aber jetzt:

Deine Frage ist nicht so einfach zu beantworten. Ich muss da stückeln. (Und auch ein bisschen spekulieren! Bin Molekular-, aber kein Mikrobiologie. Also meine Antwort bitte nich überbewerten!)

Zur Spezifität von Primern: ein Primer ist ja so meist ca. 20 Nukleotide lang. Die Wahrscheinlichkeit, dass die exakte Sequenz eines Primers zufällig in einer DNA-Sequenz vorkommt, beträgt 4 hoch 20. Ist also überirdisch klein. Heißt: eine Sequenz kann nicht zufällig vorkommen. Damit kann es schon einmal nicht passieren, dass eine völlig fremde Art falsch positiv identifiziert wird. Aber das weißt du.
Allerdings: selbst bei verwandten Arten ist es höchst unwahrscheinlich, dass sich beide Arten in einem bestimmten Sequenzabschnitt auf DNA-Ebene 100%ig in ihrer Sequenz gleichen. Denn: die DNA-Ebene unterliegt eine hohen Frequenz an Mutationen. Insbesondere, wenn man nicht kodierende Bereiche anschaut. Aber selbst, bei Protein-kodierenden Bereichen sind Mutationen auf DNA-Ebene häufig: bedenke, dass mehrere Codons dieselbe Aminosäure kodieren. Damit sind "silent mutations" unauffällig und gehen eben auch unbestraft durch!
Also, unterm Strich halte ich eine falsch positive Antwort für höchst unwahrscheinlich! Im Zweifelsfall kannst du - wenn es super wichtig ist - aber auch mit zwei oder drei Primerpaaren testen.

Zur Identifizierung von Pilzen: Ich bin mir nicht so sicher, ob es besonders Erfolg versprechend ist, mittels PCR Strategie auf die Zusammensetzung schließen zu wollen. Innerhalb einer PCR kann man nicht beliebig viele Primerpaare nutzen. Man muss also die PCRs parallel fahren. Dann kann man natürlich nur Pilze nachweisen, für die man auch ein Primerpaar benutzt! Quantitative Aussagen sind schließlich so gut wie gar nicht möglich.

Was mir als bessere Strategie erscheint: 1. Ein Microarray, speziell für die Test auf die Zusammensetzung von Pilzkulturen. So etwas gibt es bestimmt. Hier kann man aber auch wieder nur Pilze nachweisen, für die das Array geschaffen ist. (Das können aber locker auch 10.000 verschieden sein.) 2. Ein Deep Sequencing, mit dem man theoretisch alle, bekannt wie unbekannte, Sequenzen nachweisen und anschließend identifizieren kann. Hier frage ich mich aber, ob es überhaupt möglich ist, Pilze "sichtbar" zu machen, die statistisch stark unterrepräsentiert sind.

Es kommt also stark darauf an, ob du nun einzelne, spezielle bzw. zumindest ein überschaubares, klar definiertes Set an Pilzen erkennen möchtest. Oder ob du auf der anderen Seite möglichst alle, ggf. auch unbekannte Pilze identifizieren möchtest.

Bedenke schließlich noch: egal, welche Methode du benutzt. Ein Nicht-Auffinden eines Pilzes beweißt gar nichts. Nur ein positive Antwort ist zunächst ein Indiz und solle im Einzelfall verifiziert werden, falls man sich wirklich sicher sein möchte.

Hoffe, das war jetzt nicht zu deprimierend als Antwort

Freue mich auf Nachfragen. Grüße,

Theodoric.