wenn ich in einer petrischale ein pilzgemisch habe und ich will wissen welche das sind, dann muss ich doch von jedem vermuteten eine teilsequenz nehmen und die nach dna extraktion mit pcr vermehren oder?
aber was wäre denn, wenn da noch pilze dabei sind die noch nicht durchsequenziert sind und möglicherweise den primer auch in ihrem genom haben, der eigentlich für eine andere art charakteristisch sein soll?
Hallo,
Dein Teil 1 zur Identifikation ist richtig.
Zum Primer: Man berücksichtigt beim Design der Primer die Nukleotide-Länge (18-24 nt) und eine möglichst einzigartige Sequenz, um dies auszuschließen. Falls es doch ähnlich Sequenzen in anderen Genomen gibt, wird das PC-Signal (z.B. Bande im Gel) anders sein, d.h. andere Amplikongröße bzw. verschmierte Bande.
Gruß,
Ivo
Hallo,
wenn man einen artspezifischen Primer für verschiedene Pilze nehmen wollte, dann müßte man vorher wissen, welche Pilze man nachweisen wollte.
Falls es sich um ein Gemisch unbekannter Pilze handelt, sollte man eher einen universellen Primer nehmen und einen Bereich zum Sequenzieren amplifizieren.
Geeignet ist hierfür die ITS1-Region, da diese ein nicht kodierender Bereich ist und daher Mutationen keinen Selektionsdruck darstellen. Durch diese Eigenschaft hat jede Art ein spezifisches Profil und ausreichend große spezifische Sequenzunterschiede, durch die sie identifiziert werden können. Sollte man bei der Sequenzierung auf ein unbekanntes Profil mit signifikanter Abweichung zu bereits identifizierten Pilzen stoßen, kann man weitere Analysen anschließen, um die Art zu bestimmen. Für die Analyse und Bestimmung mit dieser Region stehen umfangreiche Datensätze zur Verfügung.
Ansonsten könnte man auch versuchen einen Fingerabdruck per RAPD zu erzeugen und zu analysieren, allerdings weiss ich nicht wie groß die Datenmenge und Anzahl von Datensätzen im Vergleich zu ITS1 ist. Vielleicht lohnt sich eine Recherche welche der beiden Methoden für die zu untersuchenden Proben besser geeignet wäre.
LG.
Hallo joyner,
leider bin ich auf dem Gebiet nicht so gut bewandert. Ich würde dich bitten, nochmal jemand anderen anzuschreiben.
Viele Grüße
Björn
Hallo,
um die Frage beantworten zu können, benötige ich noch ein wenig mehr Informationen. Welche Art von PCR bzw. was für eine Analyse soll gemacht werden? Mikrosateliten DNA oder Sequenzvergleich eines housekeeping genes oder was ganz anderes?
Gruss
Marcus Wrth
Das ist gut moeglich. Ich wuerde vorschlagen das Gemisch nochmal grossflaechig auszustreichen (vielleicht verschiedene Verduennungen)das am Ende Einzelkolonien wachsen sodass eine Kontaminierung durch einen anderen Pilz auszuschliessen ist.
Sorry
ich bin schon zu lange aus dem Thema. Aber ich fürchte das Problem wirst Du nicht lösen können. Wenn der Pilz nicht sequenziert ist, kannst Du es vielleicht über physiologische Tests ermitteln.
Gruß heiko
erstmal sollten von den Pilzen Einzelkolonien angefertigt werden, sonst wird das recht schwierig zuzuordnen. Dann gehe ich mal davon aus du willst eine 16S rDNA Charakterisierung vornehmen. Die Primer hierfür sind speziell für hochkonservierte DNA-Bereich designed, die in allen Spezies eine (annähernd) gleiche Basenabfolge aufweisen. Von einem Organismus der dir nicht bekannt ist kannst du ja keine spezifischen Primer ableiten. Die Primer für eine 16S rDNA Charakterisierung sind also immer einheitlich und amplifierziert werden hierbei nur Regionen des Genlokus, der für verschiedene Spezies charakteristische Sequenzen aufweist. Sind die mal amplifiziert und sequenziert kann man sie alignen, also nach übereinstimmungen untersuchen und dadurch herausfinden, um welchen Organismus es sich handeln könnte. Hoffe ich konnte dir helfen
Hallo!
- Von Pilzgenomen versteh ich nichts, daher kann ich nur eine Antwort geben, wie ich sie allgemein bei Eukaryonten geben würde.
- Ich vermute, Du wirst erst die Organismen oder Sporen vereinzeln und dann aus den einzelnen entweder direkt DNA für die PCR isolieren oder den einzelnen Organismus wachsen lassen, um dann aus dem mehrzelligen monoklonalen Organismus DNA zu isolieren. Das nur vorab, damit ich den Prozess bis zur DNA richtig verstanden habe.
- Ab der isolierten DNA hängt alles von der geschickten Wahl der Primer ab. Da ja einige Pilzgenome zumindest in großen Stücken bekann sein dürften, muss man die Primer so wählen, dass sie eine Unterscheidung der bekannten Arten ermöglichen, d.h. dass das erwartete Stück entweder im falschen Organismus entweder gar nicht amplifiziert wird, oder die Stücke aus verschiedenen Arten sich in der Länge unterscheiden. Bei zweiterem ist das Ergebnis m.E. sicherer, da „keine Amplifikation“ viele Gründe haben kann.
- Jetzt Deine Frage: Das klingt nach einer stringenten PCR gemäß der von mir als erste beschriebenen Methode. Richtig, wenn der Primer passt, wird jede Pilzart-DNA vermeht, auf die er passt, also auch eine unbekannte mit der Zielsequenz. Allerdings braucht man für eine PCR ja 2 Primer, dh. der unbekannte Pilz müsste ja schon BEIDE Zielsequenzen haben. Wenn man also die Primer beide in für die bekannten Pilzarten eindeutigen Sequenzen wählt - natürlich unter Beachtung der Längenbeschränkungen für PCR-Fragmente - erhält man entweder ein klares „NEIN“ für diese Zielsequenz, oder es ist der richtige Pilz, oder er hat halt eben genau die Zielsequenz in seinem Genom. Das klingt dann nach naher Verwandtschaft…
Die Methode finde ich insgesamt sher aufwendig, weil wenn ich das recht versteh, braucht man dazu für jede verdächtige Pilzart mindestens ein Primerpaar, das man dann an jedem Klon ausprobieren muss…
Ich hoffe, das hilft Dir weiter…
Viele Grüße
R.
Hallo Joyner,
Konnte leider nicht früher antworten. Aber jetzt:
Deine Frage ist nicht so einfach zu beantworten. Ich muss da stückeln. (Und auch ein bisschen spekulieren! Bin Molekular-, aber kein Mikrobiologie. Also meine Antwort bitte nich überbewerten!)
Zur Spezifität von Primern: ein Primer ist ja so meist ca. 20 Nukleotide lang. Die Wahrscheinlichkeit, dass die exakte Sequenz eines Primers zufällig in einer DNA-Sequenz vorkommt, beträgt 4 hoch 20. Ist also überirdisch klein. Heißt: eine Sequenz kann nicht zufällig vorkommen. Damit kann es schon einmal nicht passieren, dass eine völlig fremde Art falsch positiv identifiziert wird. Aber das weißt du.
Allerdings: selbst bei verwandten Arten ist es höchst unwahrscheinlich, dass sich beide Arten in einem bestimmten Sequenzabschnitt auf DNA-Ebene 100%ig in ihrer Sequenz gleichen. Denn: die DNA-Ebene unterliegt eine hohen Frequenz an Mutationen. Insbesondere, wenn man nicht kodierende Bereiche anschaut. Aber selbst, bei Protein-kodierenden Bereichen sind Mutationen auf DNA-Ebene häufig: bedenke, dass mehrere Codons dieselbe Aminosäure kodieren. Damit sind „silent mutations“ unauffällig und gehen eben auch unbestraft durch!
Also, unterm Strich halte ich eine falsch positive Antwort für höchst unwahrscheinlich! Im Zweifelsfall kannst du - wenn es super wichtig ist - aber auch mit zwei oder drei Primerpaaren testen.
Zur Identifizierung von Pilzen: Ich bin mir nicht so sicher, ob es besonders Erfolg versprechend ist, mittels PCR Strategie auf die Zusammensetzung schließen zu wollen. Innerhalb einer PCR kann man nicht beliebig viele Primerpaare nutzen. Man muss also die PCRs parallel fahren. Dann kann man natürlich nur Pilze nachweisen, für die man auch ein Primerpaar benutzt! Quantitative Aussagen sind schließlich so gut wie gar nicht möglich.
Was mir als bessere Strategie erscheint: 1. Ein Microarray, speziell für die Test auf die Zusammensetzung von Pilzkulturen. So etwas gibt es bestimmt. Hier kann man aber auch wieder nur Pilze nachweisen, für die das Array geschaffen ist. (Das können aber locker auch 10.000 verschieden sein.) 2. Ein Deep Sequencing, mit dem man theoretisch alle, bekannt wie unbekannte, Sequenzen nachweisen und anschließend identifizieren kann. Hier frage ich mich aber, ob es überhaupt möglich ist, Pilze „sichtbar“ zu machen, die statistisch stark unterrepräsentiert sind.
Es kommt also stark darauf an, ob du nun einzelne, spezielle bzw. zumindest ein überschaubares, klar definiertes Set an Pilzen erkennen möchtest. Oder ob du auf der anderen Seite möglichst alle, ggf. auch unbekannte Pilze identifizieren möchtest.
Bedenke schließlich noch: egal, welche Methode du benutzt. Ein Nicht-Auffinden eines Pilzes beweißt gar nichts. Nur ein positive Antwort ist zunächst ein Indiz und solle im Einzelfall verifiziert werden, falls man sich wirklich sicher sein möchte.
Hoffe, das war jetzt nicht zu deprimierend als Antwort 
Freue mich auf Nachfragen. Grüße,
Theodoric.
NACHTRAG
Habe gerade die Antworten der anderen gelesen und kann teils nicht zustimmen:
Solltest du dich für eine PCR-Strategie entscheiden, dann sehe ich keine Notwendigkeit zur Vereinzelung!
Das ist ja gerade Sinn und zweck einer PCR! Prüfe ich mit PCR, ob ein Pilzgemisch den Pilz XYZ enthält, dann bekommen ich nur ein positive Antwort, wenn dem so ist. Dann weiß ich, das Gemisch enthält jenen Pilz XYZ.
Wenn ich dagegen vorher vereinzele, habe ich gar keine Chance mehr, unterrepräsentierte Pilze zu identifizieren. Wie viele Kolonien soll man denn picken, wenn - sagen wir mal - nur jede 500. Kolonie vom nachzuweisenden Pilz abstammt?
Zudem weiß man ja gar nicht, ob alle Pilze in Verdünnung gleich gut anwachsen werden. (Das ist sowieso und überhaupt ein Problem!) Diese Strategie halte ich nur für brauchbar, wenn man die Pilze
nachweisen will, die am häufigsten vertreten sind. Das hängt nun aber wirklich von deiner Fragestellung ab.
Grüßigst!
Guten Tag,
Mikrobiologisch: zuerst einmal überimpfen und vereinzeln, genau wie mit Bakterien. Insbesondere in Kombination mit Next generation Sequenzierung (aber auch PCR+zB spezifische Microarrays) funktioniert aber sicherlich auch eine 18S Sequenzierung. Ribosomale DNA Sequenzen haben konservierte Regionen, in die man die Primer legen kann, und variable Regionen, die speziesspezifisch sind, dh aus einer Mischung macht man 18S (auch 5S, 23S, bzw 16S bei Bakterien) PCR und sieht sich dann an, welche Spezies tatsächlich vorhanden sind. Hoffe, das war nicht zu kompliziert ausgedrückt LG M
was wäre denn, wenn da noch pilze dabei sind die noch
nicht durchsequenziert sind und möglicherweise den primer auch
in ihrem genom haben, der eigentlich für eine andere art
charakteristisch sein soll?
Dann hat man ein Problem. Daher sollte man mehrere spezifische Primer benutzen, so dass die Chance reduziert wird gleich zwei Pilze mit seinen Primern zu treffen.
Außerdem sollten zwar die Primer in konservierten Bereichen (z.B. einem Gen) binden, aber die Sequenz auch hochvariable Bereiche mit einschließen (z.B. ein Intron) weil da eher Muationen auftauchen und man so Unterschiede besser identifizieren kann.
Gruß,
Sax
Hmmm … hier scheint ein alter Artikel liegen geblieben zu sein …
NACHTRAG
Habe gerade die Antworten der anderen gelesen und kann teils nicht zustimmen:
Solltest du dich für eine PCR-Strategie entscheiden, dann sehe ich keine Notwendigkeit zur Vereinzelung!
Das ist ja gerade Sinn und zweck einer PCR! Prüfe ich mit PCR, ob ein Pilzgemisch den Pilz XYZ enthält, dann bekommen ich nur ein positive Antwort, wenn dem so ist. Dann weiß ich, das Gemisch enthält jenen Pilz XYZ.
Wenn ich dagegen vorher vereinzele, habe ich gar keine Chance mehr, unterrepräsentierte Pilze zu identifizieren. Wie viele Kolonien soll man denn picken, wenn - sagen wir mal - nur jede 500. Kolonie vom nachzuweisenden Pilz abstammt?
Zudem weiß man ja gar nicht, ob alle Pilze in Verdünnung gleich gut anwachsen werden. (Das ist sowieso und überhaupt ein Problem!) Diese Strategie halte ich nur für brauchbar, wenn man die Pilze
nachweisen will, die am häufigsten vertreten sind. Das hängt nun aber wirklich von deiner Fragestellung ab.
Grüßigst!
Guten Tag,