Liebe Experten,
ich habe Gesamt-RNA in eine RT-PCR gegeben und die mRNA mittels Oligo-dT-Primer in cDNA umgeschrieben (RT-Kit der Fa. Qiagen).
Die cDNA möchte ich (nicht zielgerichtet, sondern insgesamt) amplizifieren, dafür Random-Hexamere als Primer verwenden.
Hat jemand damit Erfahrung, ein Protokoll zur Hand? Mich interessiert besonders das Thermoprofil.
Gruß und Dank,
Kyna
Hallo,
darf ich fragen, warum du kein full-length cDNA amplification protocol verwendest? (zB. SMART o.ä. „cDNA library cloning kits“)
Mich interessiert besonders das Thermoprofil.
Für das Annealing von Hexameren muss man recht niedrige Temperaturen wählen. Nach der AT/GC-Regel ca. 3x2+3x4°C = 20°C. 25°C sollten auch funktionieren. Extension und Denaturierung wie üblich.
Bei diesem Protokoll wirst du dir sehr kurze Amplifikate „züchten“. Daher wird eine sehr lange Extensionsdauer nicht notwendig sein. 1-2 min werden vollkommen ausreichen.
LG
Jochen
Hallo Jo!
darf ich fragen, warum du kein full-length cDNA amplification
protocol verwendest? (zB. SMART o.ä. „cDNA library cloning
kits“)
Ich würde es gerne per Hand versuchen, Kits sind ja immer so teuer… Von Clontech hatten wir da auch mal was, aber da kostet die Probe um und bei 100€.
Mich interessiert besonders das Thermoprofil.
Für das Annealing von Hexameren muss man recht niedrige
Temperaturen wählen. Nach der AT/GC-Regel ca. 3x2+3x4°C =
20°C. 25°C sollten auch funktionieren. Extension und
Denaturierung wie üblich.
Da wundert mich, dass beispielsweise bei oben genanntem Kit 60°C verwendet werden…!?
Bei diesem Protokoll wirst du dir sehr kurze Amplifikate
„züchten“.
Was meinst du damit? Mit kleinen Bruchstücken kann ich wenig anfangen…
LG,
Kyan
Hallo,
Da wundert mich, dass beispielsweise bei oben genanntem Kit
60°C verwendet werden…!?
Für das Annaeling der Hexamere? Die Kits haben meist längere Primer mit einem randomisierten Terminus, so dass die eigentliche Amplifikation mit spezifischen Primern arbeitet.
Was meinst du damit? Mit kleinen Bruchstücken kann ich wenig
anfangen…
Hmm… ich dachte so: Wenn du konkret immer imt Hexameren primen willst, binden die immer irgendwo. Damit generierst Du 2nd-strands, die irgendwo auf dem 1st-strand beginnen, aber spätestens an dessen Ende aufhören. Im Mittel sind die also kürzer als die 1st-strands. Im nächsten Zyklus sind das schon wieder kürzere Templates usw.
LG
Jochen
Hmm… ich dachte so: Wenn du konkret immer imt Hexameren
primen willst, binden die immer irgendwo. Damit generierst Du
2nd-strands, die irgendwo auf dem 1st-strand beginnen, aber
spätestens an dessen Ende aufhören. Im Mittel sind die also
kürzer als die 1st-strands. Im nächsten Zyklus sind das schon
wieder kürzere Templates usw.
Verstehe - Ich hatte gehofft, dass die Einzelfragmente sich zusammensetzen (ich meine das so in etwa wie Ogazaki-Fragmente).
Hast du einen Tipp für mich? Was würdest du machen?
Verstehe - Ich hatte gehofft, dass die Einzelfragmente sich
zusammensetzen (ich meine das so in etwa wie
Ogazaki-Fragmente).
Das Problem dabei ist m.E. dass wenn die Fragmente mal als Primer gedient haben, ja „verbraucht“ sind. Für die exponentielle Amplifikation brauchst Du einen großen Überschuß - und das sind die Hexamere…
Hast du einen Tipp für mich? Was würdest du machen?
Wenn kein Geld und keine anderen Mittel da sind, würde ich es *probieren*. Um die Kiste zu optimieren, brauchst Du vorher ein einfaches und billiges Testsystem. Hast Du sowas? (irgendwas, womit du möglichst schnell und einfach messen kannst, ob die PCR das macht, was sie *soll*).
LG
Jochen