Ich hab hier eine Proteinlösung, welche als Verunreinigung wahrscheinlich DNA oder RNA enthält (ich hab am UV/Vis-Spektrometer eine Absorptionsbande bei 260 nm). Scheinbar kann ich durch Dialyse einen großen Teil der Nukleinsäure entfernen, aber leider krieg ich nicht alles raus. Ich kann zwar jetzt mit UV/Vis keine Nukleinsäure mehr nachweisen, aber ich hab auf dem PAGE-Gel immer noch „Dreck“ in den Taschen liegen und nehme an, das sind die DNA-Fäden.
Hat jemand eine Idee, wie ich die DNA da rausbekomme?
Oder andersrum: gibt es eine einfache (!) und sensitive Möglichkeit, die DNA in der Proteinlösung zuverlässig nachzuweisen?
Ist die Proteinlösung empfindlich gegen Hitze- Denaturierung ? Wenn nicht, RNase zusetzen, inkubieren und dialysieren ?
Über DNase weiss ich nicht Bescheid, sollte aber ebenfalls möglich sein.
Udo Becker
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Hat jemand eine Idee, wie ich die DNA da rausbekomme?
Ich wuerde die Proteinloesung auch mit DNase behandeln. Sollte das nicht zum gewuenschten Erfolg fuehren, dann ist mit grosser Wahrscheinlichkeit NICHT die DNA Schuld (ueber RNA brauchst Du Dir normalerweise keine Sorgen machen, da RNA sehr labil ist und von RNasen (in der Loesung oder aus der Umwelt) rasch abgebaut wird).
Oder andersrum: gibt es eine einfache (!) und sensitive
Möglichkeit, die DNA in der Proteinlösung zuverlässig
nachzuweisen?
Spektrometer sollte doch recht sensitiv sein. Findest Du da nichts mehr an DNA, dann hast Du wahrscheinlich auch keine DNA mehr. Alternativ kannst Du natuerlich Deine Probe auf einem Agarosegel auftrennen (mit Ethidium Bromid zum Anfaerben der DNA) und nach DNA schauen. Das ist wohl nicht so sensitiv aber dafuer siehst Du auch nur DNA waehrend das Absorptionsspektrum im Spektrometer ja evtl. durch Verunreinigungen verfaelscht sein kann.
Viel Erfolg!
Marcus
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Warum Hitze?
Bei welcher Temperatur funktioniert die RNAse/DNAse denn am besten? Hab irgendwie Angst, daß bei Temperaturerhöhung die Proteine von irgendwelchen Proteasen angegriffen werden…
viele Grüße,
Steffen
Ist die Proteinlösung empfindlich gegen Hitze- Denaturierung ?
Wenn nicht, RNase zusetzen, inkubieren und dialysieren ?
Über DNase weiss ich nicht Bescheid, sollte aber ebenfalls
möglich sein.
Udo Becker
Danke für die Antwort! Fürs Labor ist DNAse durchaus in Betracht zu ziehen. Hast Du vielleicht ein Protokoll da (Menge DNAse, Temperatur, Inkubationszeit)?
Die Frage nach der Menge hat einen Grund: Ich würde die Reinigung auch gerne in größerem Massstab durchführen; da wäre DNAse wohl eher nicht angebracht (zu teuer). Hast Du eine Idee, was man da machen kann?
viele Grüße,
Steffen
Hallo Steffen:
Hat jemand eine Idee, wie ich die DNA da rausbekomme?
Ich wuerde die Proteinloesung auch mit DNase behandeln. Sollte
das nicht zum gewuenschten Erfolg fuehren, dann ist mit
grosser Wahrscheinlichkeit NICHT die DNA Schuld (ueber RNA
brauchst Du Dir normalerweise keine Sorgen machen, da RNA sehr
labil ist und von RNasen (in der Loesung oder aus der Umwelt)
rasch abgebaut wird).
Oder andersrum: gibt es eine einfache (!) und sensitive
Möglichkeit, die DNA in der Proteinlösung zuverlässig
nachzuweisen?
Spektrometer sollte doch recht sensitiv sein. Findest Du da
nichts mehr an DNA, dann hast Du wahrscheinlich auch keine DNA
mehr. Alternativ kannst Du natuerlich Deine Probe auf einem
Agarosegel auftrennen (mit Ethidium Bromid zum Anfaerben der
DNA) und nach DNA schauen. Das ist wohl nicht so sensitiv aber
dafuer siehst Du auch nur DNA waehrend das Absorptionsspektrum
im Spektrometer ja evtl. durch Verunreinigungen verfaelscht
sein kann.
Viel Erfolg!
Marcus
Hallo!
Ich hab hier eine Proteinlösung, welche als Verunreinigung
wahrscheinlich DNA oder RNA enthält (ich hab am
UV/Vis-Spektrometer eine Absorptionsbande bei 260 nm).
Scheinbar kann ich durch Dialyse einen großen Teil der
Nukleinsäure entfernen, aber leider krieg ich nicht alles
raus. Ich kann zwar jetzt mit UV/Vis keine Nukleinsäure mehr
nachweisen, aber ich hab auf dem PAGE-Gel immer noch „Dreck“
in den Taschen liegen und nehme an, das sind die DNA-Fäden.
Hat jemand eine Idee, wie ich die DNA da rausbekomme?
Oder andersrum: gibt es eine einfache (!) und sensitive
Möglichkeit, die DNA in der Proteinlösung zuverlässig
nachzuweisen?
Naja kommt drauf an was es für ein Protein ist. Normalerweise sollte man Proteinlösungen ja so kühl wie möglich bearbeiten, sprich um die 0°C wenn man Proteine aufreinigt und aufkonzentrieren will. Sonst kommen die bösen Proteasen und dann isses unter Umständen vorbei mit nem nativen Protein und dessen Aktivität. Würde also auf aufkochen etc. unbedingt verzichten und DNasen sowie RNasen für 30min bei 0-4°C (auf Eis) verwenden um die Verunreinigung zu eliminieren.
Wenn du dann immer noch „irgendwas“ in den Taschen siehst isses ganz bestimmt keine DNA oder RNA mehr. Oftmals fallen auch Proteine selber bei eine Gelelektrophorese innerhalb der Tasche aus wenn die Konzentration einfach viel zu hoch ist.
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Schaue mal im Katalog von Sigma nach. Dort gibt es DNase in lyophylisierter Form und die ist doch auch nicht so teuer, oder? Auf der Internetseite von Sigma bekommst Du auch eine Anleitung zu Menge und Temperatur. An Details kann ich mich leider nicht mehr so erinnern. Als ich zaehfluessige Proteinproben hatte, habe ich eine Spatelspitze DNase dazugegeben und dann bei 37C solange inkubiert, bis es nicht mehr zaehfluessig war (10 oder 20min). „Spatelspitze“ ist natuerlich relativ und meistens ging es dann nach dem Motto „Viel hilft viel“. Hey, wer hat jemals behauptet, dass Molekularbiologie eine exakte Wissenschaft ist??
Reinigung auch gerne in größerem Massstab durchführen; da wäre
DNAse wohl eher nicht angebracht (zu teuer). Hast Du eine
Je nachdem wie gross der grosse Massstab ist, kannst Du immer noch DNase zuschuetten (evtl. laengere Inkubationszeit). Eine Alternative ist die Verwendung von Ultraschall, falls das Deinen Proteinen nichts ausmacht. Durch den Ultraschall wird die DNA in kleine Stuecke gerissen und somit solltest Du keine zaehfluessige Loesung mehr bekommen. Vielleicht kannst Du auch am Protokoll Deiner Proteinaufreinigung etwas rumfeilen, um die DNA schon in einem frueheren Schritt wegzubekommen. Ich ueberlege mal, ob mir noch etwas anderes einfaellt.
Viele Gruesse,
Marcus
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Du kannst natürlich auch eine „richtige“ Aufreinigung z.B. per Chromatographie in Betracht ziehen. Gerade im größeren Massstab macht das Sinn. Wie „gross“ soll denn der Massstab werden? Es kann natürlich auch sehr aufwendig und teuer werden, da das richtige herauszusuchen, auszuprobieren etc.
Aber es gibt doch bestimmt auch so Kits (ok, auch teuer), mit denen man Protein-Proben im Kleinst-Massstab reinigen kann??? Tut mir Leid, aber da ist meine Erinnerung aus dem Studium sehr dunkel! Zur Zeit beschäftige ich mich eher mit Proteinreinigung von „größeren“ Mengen (so im Gramm-Bereich; „groß“ ist ziemlich relativ).
Vielleicht hilft Dir auch so eine Seite weiter: http://www6.gelifesciences.com/aptrix/upp01077.nsf/C… ? Das ist jetzt spontan der erste Hersteller, der mir einfällt und Lösungen für Analytik und präparative Mengen anbietet…
Danke für Deine Anwort! Die Sache ist nicht rekombinant (deswegen eher keine Kits) und soll durchaus bis weit in den Gramm-Bereich gehen.
Weißt Du, wo ich so große Säulen herbekomme (und möglichst billig soll es auch noch sein…)?
viele Grüße,
Steffen
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Hey Steffen!
Ui, das Thema Aufreinigung ist gar nicht so ohne!
Wichtig ist, zu wissen, was in der Ausgangslösung drin ist, wie die Reinheit am Ende sein soll, und was das Zielprotein (und wenn möglich die Verunreinigungen) für Eigenschaften haben. Ich sage mal, der Klassiker für die Trennung von Proteinen von DNA wäre ein Kationenaustausch. Und je nach End-Reinheit, oder wenn noch andere Proteine stören, müßte man zu einem mehrstufigen Prozess mit ein oder mehr anderen Techniken greifen (z.B. Size Exclusion, Reversed-Phase-Chromatographie…).
Der Link, den ich letztes Mal gepostet habe, war von GE Healthcare (eh. Amersham Biosciences, davor noch Pharmacia). Die bieten halt so ziemlich alles zum Thema Aufreingung - von Proben-Mengen (hatten die nicht so kleine „Spin-Säulen“ im Eppi-Format für SDS-PAGE u.a?!), über Entwicklungsmaßstab (z.B. 1 cm-Säulen), bis hin zum Gramm-/Kg-Bereich mit den passenden Chromatographie-Anlagen, Säulen (bis 2 m Deurchmesser? oder gibts da auch schon wieder was größeres?!) und Säulenmaterialien. Dummerweise ist der Hersteller ziemlich teuer!
Umsonst sind bei denen aber die „Handbücher“ (z.B. „Protein Purification“, unter http://www1.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/C… ), die imho einen wirklich guten Überblick für Anfänger, Einsteiger etc. bieten!
