Hallo!
Bei der Schmelpunktanalyse von PCR-Produkten mit SYBR Green misst man ja die Fluoreszenz gegen die Temperatur. Als Schmelzpunkt des spezifischen Produkts wird die Temperatur des Hochpunkts der negativen Ableitung der Fluoreszenz gegen die Temperatur angenommen.
Soweit so gut.
In der gemessenen Kurve Fluoreszenz gegen temperatur finde ich jedoch etwas komisch. Erwartet hätte ich eine Kurve wie
http://s4.directupload.net/file/d/1323/62pf4iss_jpg.htm
Tatsächlich sieht sie jedoch eher so aus
http://s4.directupload.net/file/d/1323/ijrtn6rb_jpg.htm
Wie kommt die Steigung im ersten Bereich vor dem spezifischen Schmelzpunkt?
Ich habe bisher zwei Versionen gehört. Es seien AT-reiche Sequenzen, die teilweise schon vorher aufschmelzen oder aber, dass die Fluoreszenz von interkaliertem SYBR Green temperaturabhängig ist.
Als dritte Möglichkeit könnte ich mir vorstellen, dass SYBR Green aus Gründen der Entropie bei steigender Temperatur teilweise aus dem Doppelstrang herausdiffundiert und sich dadurch die Fluoreszenz verringert, obwohl die DNA-Doppelhelix noch überhauptnicht denaturiert ist.
Weiß einer, wie es genau funzt?
Viele Grüße, Stefan