HAllo wwwler!
Ich habe 2 Fragen zur Transfektion/Transformation:
Weiß jemand, ob bei der Transfektion von Eukaryoten auch Plasmide eingeschleust werden?
Wie wird die einzubringende DNA vor dem VEedau durch Nukleasen in der Zielzelle geschützt? Wird die DNA vorher methyliert oder hofft man eindfach druch Einschleusen einer entsprechend hohen Kopienanzahl der DNA, dass wenigstens ein DNA-Fragemnt unverdaut eingebaut wird?
DAnke für Antworten!
grüße
ladydi
Hallo,
und bei 2: mit der genauen Methylierung bin ich mir nicht ganz sicher. Aber ein wichtiger Punkt bei der Transfektion mit Plasmiden ist, dass man mit dem Plasmid ein bestimmtes Resistenzgen in die Zelle einbringt. Um also sicher zu gehen, dass die transfizierten Zellen die Fremd-DNA nicht abbauen, selektiert man mit einer bestimmmten Chemikalie (Antibiotikum bei Bakterien). Und im Idealfall überleben nur die Zellen, die auch wirklich das Plasmid aufgenommen haben, da nur diese resistent sind.
Grüße
Hallo,
zu 2:
Methylierung ist bei Eukarytoten unüblich und auch wenig sinnvoll. Im Ggs. zu Prokaryoten hat es i.d.R. noch keine Folgen, wenn DNA im Zellplasma rumschwimmt. Erst im Zellkern könnte die DNA einen Effekt machen. Daher leisten sich Eukaryoten auch keine DNasen im Zellplasma.
Außerdem dient die Methylierung bei Eukaryoten soweit man weiß auch nicht dem Schutz vor Degradation, sondern zur Genregulation. Wesentliche Teile der genomischen DNA sind unmethyliert und wären in den Kern diffundierenden DNasen ausgeliefert. Keine gute Idee.
Ich frage mich aber gerade, wie die Plasmide denn exprimiert werden, sofern sie nicht gezielt in den Kern geschleußt werden. Entweder ein Molekül diffundiert rein oder aber es geht in Mitos (oder Chroroplasten), die auch einen Transkriptionsapparat haben. Das würde man an den verwendeten Aminosäuren feststellen können. Weiß da jemand was?
LG
Jochen