Hallo,
ich moechte eine Enzymreaktion verlangsamen.
Fuer die Reaktion brauche ich mein Enzym, einen Cofaktor und ein Substrat.
Ich moechte die Umsetzung des Substrates messen, was ich ueber die Veraenderung in der Absorption des Cofaktors kann. Spaeter moechte ich dann verschiedene Stoffe dazu geben um zu sehen, ob das Enzyme gehemmt wird.
Ich habe das ganze etabliert und es funktioniert. In einer Kuevette in einem 1 ml Volumen. Die Reaktionsdauer die ich Messe ist eine Minute und ich messe alle 2 Sekunden die Absorption.
Jetzt moechte ich das Volumen verkleiner und die Messdauer verlaengern.
Mein Zielvolumen ist 0.1 ml. Ich habe in der Literatur gesucht und fuer mein Experiment gefunden, dass meistens die Haelfte an Cofaktor und Substrat eingesetzt wird. Wenn ich jetzt auch die Haelfte an Enzym einsetzte, bleibt die Reaktionsdauer dann nicht dieselbe?
Wie kann ich am effektivsten die Reaktionsdauer verlaengern, so dass ich auch bei laengeren Messungen noch im Steady-State-Bereich vom Enzym bin?
Mein Ziel sind 10-30 Minuten.
Danke im Vorfeld!
Gruss
Ich habe in der Literatur gesucht
und fuer mein Experiment gefunden, dass meistens die Haelfte
an Cofaktor und Substrat eingesetzt wird. Wenn ich jetzt auch
die Haelfte an Enzym einsetzte, bleibt die Reaktionsdauer dann
nicht dieselbe?
Wenn Cofaktor und Enzym im großen Überschuss vorliegen, kann das passieren. Dann hat die Verringerung der Cofaktorkonzentration kaum Wirkung und die Kinetik ist größtenteils pseudo-nullter Ordnung bezüglich des Substrates. Die Gesamtreaktionsdauer wäre dann in guter Näherung proportional zum Quotienten der eingesetzten Substrat- und Enzymmengen und der bleibt natürlich konstant, wenn man beide halbiert.
Liegen die Konzentrationen von Cofaktor und Substrat aber in einer ähnlichen Größenordnung wie die Enzymkonzentration, dann sieht das schon ganz anders aus. Sieh’ Dir mal die Michaelis-Menten-Kinetik an. Damit kann man abschätzen, wie das System auf Änderungen der Ausgangskonzentrationen reagieren wird.
Wie kann ich am effektivsten die Reaktionsdauer verlaengern,
so dass ich auch bei laengeren Messungen noch im
Steady-State-Bereich vom Enzym bin?
Mein Ziel sind 10-30 Minuten.
Da sehe ich prinzipiell drei Möglichkeiten:
- weniger Cofaktor
- weniger Enzym
- mehr Substrat
Du solltest aber immer darauf achten, Dich nicht zu weit von den physiologischen Bedingungen zu entfernen. Ich würde vorschlagen, erst einmal mit genügend Cofaktor zu arbeiten und nur an den Konzentrationen von Enzym und Substrat herumzuschrauben.
Wenn Du Deine Messungen dann mit allen Substanzen durch hast, kannst Du - wenn genügend Zeit und Mittel bleiben - diejenigen, die zu einer Hemmung des Enzyms geführt haben, noch einmal mit einem Mangel an Cofaktor testen (natürlich wieder nach Einstellung der geeigneten Reaktionsgeschwindigkeit durch Variation der Enzym- oder Substratkonzentration). So erhälst Du auf einfache Einweise ein Hinweis darauf, ob die jeweilige Substanz nur auf das Enzym oder auf den Enzym·Coenzym-Komplex wirkt. Das wiederum lässt erste Rückschlüsse auf den Wirkungsmechanismus zu (besonders wenn man noch die Struktur aller beteiligten Proteine kennt). Wenn man die Möglichkeit hat, sollte man sich das nicht entgehen lassen.
Ich moechte eine Enzymreaktion verlangsamen.
DrStupid hat schon sehr gute Hinweise gegeben. Produkthemmung durch Zugabe des Reaktionsprodukts fällt mir noch ein (weil Enzymreaktionen reversibel sind), außerdem Substrathemmung durch ein falsches, ähnliches oder schlechteres Substrat. Was auch verlangsamt, sind physikalische Reaktionsbedingungen wie Verlassen des pH Optimums, Erhöhung der Salzkonzentration und Zugabe von verschiedenen Alkoholen. Beispiel: 10% Propanol, 10 % Äthanol etc. Durch Alkohol bedingt kann sich aber die Spezifität des eingesetzten Enzyms verändern. Temperatur absenken ist Dir wohl selbst auch schon eingefallen.
Udo Becker