Hallo!
Kann mir jemand sagen, wie man untersuchen kann (oder optimalerweise wie man es tatsächlich macht), ob bestimmte DNA-Sequenzen in Gewebeproben oder aber Zellkulturen methyliert sind?
Hierbei denke ich besonders an Methylierung in Promoterregionen von Genen (die onkologisch relevant sind, aber das ist an dieser Stelle wohl irrelevant).
Vielen Dank bereits an dieser Stelle für hilfreiche Antworten,
Stefan
Hi
Ich könnte mir vorstellen, dass man den Methylteil vor der Replikation bestimmt markieren kann. So ähnlich wie bei der Sequenzierung nach Sanger-Coulson.
Hallo Stefan,
mir ist die Bisulfit-Behandlung bekannt. Zuerst wird die genomische DNA verdaut, wobei die Restriktionsendonuklease nicht in der Zielsequenz schneiden darf. Anschließend werden durch die Bisulfit-Behandlung in 3 Schritten ausschließlich unmethylierte Cytosine zu Uracilen konvertiert. Nach der Standard-PCR mit den üblichen dNTP wird schließlich U zu T, die beiden DNA-Stränge sind dann auch nicht mehr komplementär. Danach wird die DNA nach Gelextraktion der entsprechenden Bande in E. coli kloniert und mit positiven Klonen Colony PCRs durchgeführt. Die Colony PCR-Produkte werden sequenziert. Durch den Vergleich dieser Sequenzen mit der Sequenz unbehandelter DNA können die Methylytosine von den unmethylierten Cytosinen unterschieden werden. Bei dem Vergleich wird also die Konvertierung von CpG-Cytosinen zu Thyminen gesucht. Die unkonvertierten CpG-Cytosine müssen folglich methyliert sein.
Ich muss das in irgendeinem Ordner verschollene Protokoll erst noch suchen, ich melde ich mich dann wieder per Email. Bestimmt findest du dazu auch was im Netz.
LG
Huttatta