Hallo!
In einem flureszenzgekoppelten Antikörper, den ich für Immunfluoreszenzen benutze, ist irgendein fluoreszierender Dreck drin.
Das ärgert mich natürlich. Der Antikörper ist mit Alexa 594 gekoppelter goat anti rat IgG, der nach Anregung mit grünem Licht im Rotkanal leuchtet. Im Rotkanal strahlt der Dreck auch besonders stark rot. Die Farbe scheint der des spezifischen Signals sehr ähnlich oder identisch zu sein.
Der Dreck leuchtet aber sogar (wenn auch schwach) rot im DAPI Kanal. Im Grünkanal sehe ich davon nichts.
Hat einer eine Idee was das sein könnte?
Vielleicht ein Antikörperaggregat?
Könnte man das durch Zentrifugation entfernen?
Und wenn ja, wie könnte man das denn loswerden?
(Im Moment hab ich leider kein Bild da, denn bei den Aufnahmen hab ich die Dreckflecken ha vermieden zu fotografieren.)
Viele Grüße, Stefan
Hallo!
Am wahrscheinlichsten handelt es sich um den AK bzw. um Aggregate davon („normaler“ Dreck wie Fussel aber auch Ölpartikel etc. fluoresziert meist im Grünkanal und nicht im Rotkanal). Eigentlich sollte sowas beim Waschen weggewaschen werden. Ich würde mal deutlich rigider waschen (spezifisch gebundenen AK sollte das nichts ausmachen).
Abzentrifugieren von Aggregaten ist m.E. nicht so einfach möglich, weil die Aggregate nicht wesentlich besser sedimentieren als die anderen AK. Du erreichst keine gute Trennung. Wenn die Aggregate natürlich seeeehr groß sind…
Du könntest mal eine Verdünnung der AK-Lösung direkt unter dem Fluoreszenzmikroskop anschauen und nachsehen, ob das eine gleichmäßig rote Brühe ist oder ob da schon „Dreck“ drinne ist.
Ach ja, ich würde halt auch nochmal alles andere genau durchgehen: Blocking etc.
LG
Jochen
Hallo Jochen!
Vielen Dank schonmal für die Antwort.
Der Dreck muss wirklich in dem Antikörper sein. Ich habe eine ganze Zahl verschiedener Färbungen gemacht und dieser Dreck tauchte immer genau dann auf, wenn dieser eine Antikörper benutzt wurde, obwohl Blocksolution, AK-Verdünnungslösung, Waschpuffer etc. immer identisch waren.
Die Klumpen sind halt echt groß, oft so groß wie ein Ery und haben eine sehr scharfe Begrenzung.
Gruß, Stefan
Hi,
so groß wie Erys?! Das ist ja was.
Wenn ihr Ultrafilter habt (zB. um Viren zu filtrieren), würde ich die AK-Lösung mal da durchjagen. Brocken in der Größe von Erys sollten damit zuverlässig zurückgehalten werden können.
Viel Erfolg noch!
LG
Jochen