Hallo,
ich habe ein paar wichtige Fragen zur PCR und zur Gelelektrophorese. Ich bedanke mich schon mal im Vorraus für eure Hilfe.
Also hier nun meine Fragen :
Warum muss eine PCR eigentlich mindestens 2 1/2 Stunden laufen? Bitte, wenn möglich, mit Begründung.
Welche Eigenschaften muss ein Primer für die PCR haben und warum ?
Und was hat eigentlich der Puffer bei der Gelelektrophorese für eine Bedeutung ?
Mfg James
Hallo James,
Warum muss eine PCR eigentlich mindestens 2 1/2 Stunden laufen? Bitte, wenn möglich, mit Begründung.
->Geht auch schneller, meistens kurze Aufwärmphase (10’ 95°C), dann 20 bis 40 Zyklen zu je 3x10 sec; deren Länge ist abhängig von deiner Fragmentgröße sowie der Ausgangsmenge an Template DNA. Abschließend ein paar Minuten, damit die Taq Lücken füllen kann. Bei kurzen Fragmenten nicht notwendig. Um die Zeit zu verkürzen kannst auch eine Two-Step-PCR anwenden (musste mal googlen, wie das geht…)
Welche Eigenschaften muss ein Primer für die PCR haben und warum ?
-> Kannst Du googeln
-> http://www.pcr-online.org/Protocols%20primer%20desig…
Und was hat eigentlich der Puffer bei der Gelelektrophorese für eine Bedeutung ?
-> Guckst Du hier, am besten auf Seite 9:
http://www.tci.uni-hannover.de/pdf/Elektrophoretisch…
Gruß,
Ivo.
Hallo,
ich habe ein paar wichtige Fragen zur PCR und zur
Gelelektrophorese. Ich bedanke mich schon mal im Vorraus für
eure Hilfe.
Also hier nun meine Fragen :Warum muss eine PCR eigentlich mindestens 2 1/2 Stunden
laufen? Bitte, wenn möglich, mit Begründung.
Erstens weiß ich nicht, ob Du eine Realtime-PCR oder eine PCR, die mit einem Gel nachgewiesen werden soll, meinst. Prinzipiell gibt es keine Begründung, warum eine PCR so oder so lange laufen soll. Normalerweise macht man aber zwischen 30 und 40 Zyklen, bevor genügend Amplifikate gebildet worden sind. Die sind notwendig, um das Signal überhaupt sehen zu können.
Welche Eigenschaften muss ein Primer für die PCR haben und
warum ?
Ein Primerpaar sollte spezifisch für das Zielgen sein. Am besten generierst Du die Primer als „Intron“-Spanning Primer. Dies bedeutet, dass die Primer über nicht codierende Abschnitte im Genom liegen sollte. Damit kannst Du dann verhindern, dass bei einer DNA-Kontamination Deiner isolierten RNA die DNA mit amplifiziert wird, weil die DNA ja viel länger als die RNA ist und so das Zeitfenster eines Zyklus nicht ausreicht, die DNA zu amplifizieren.
Zum Primer generieren empfehle ich Dir folgenden link, der selbser für Intronspanning sorgt:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/.
Und was hat eigentlich der Puffer bei der Gelelektrophorese
für eine Bedeutung ?
Der Puffer in einer Gelelektrophorese sorgt dafür, dass Ladungsunterschiede der einzelnen Proben, die aufgetragen werden, relativ kompensiert werden und dass die Proben im Gel über die gesamte Laufzeit der Elektrophorese unter homogenen Bedingungen aufgetrennt werden können. Normalerweise ist die Wanderungsgeschwindigkeit einer Probe im Gel abhängig von der Molekülgröße und der Nettoladung des Moleküls. Der Puffer sorgt für einen Überschuß an negativen Ladungen, so dass sich die Proben rein nach ihrem Molekulargewicht bewegen (je kleiner desto weiter). Anhand einer Standardleiter kannst Du dann prüfen, ob Deine cDNA-Bande Deinem gesuchten Amplifikat entspricht.
So, ich hoffe, die Infa war hilfreich für Dich.
Schöne GRüße und viel Erfolg, Michael
Mfg James
Hallo James,
Ich konnte die letzten Tage leider nicht in meine Emails schauen. Melde Dich nochmal, falls Du noch Antworten auf Deine Fragen bedarfst.
Viele Gruesse,
Marcus