Schon fast färtig XD
Ja ich danke dir für die Information XD
UND NOCH ETWAS DIE SEITE SOLLTE LIEBER EIN ETWAS ÜBERSICHTLIHERES FORUM ANLEGEN!!! HAB AUCH SCHON EINE VORLAGE FÄRTIG XD
So dann will ich mal das erarbeitete mal vorstellen, und falls Fehler im text sind, dann einfach sagen
[SPOILER=Die Gewinnung eines Gens]Die Gewinnung eines Gens[/SPOILER]
Unter dem Begriff „Genetik“ fast man die Verfahren zusammen, durch die fremde Gene in Zelle übernommen werden. Auch d. Analyse, Veränderung und Vervielfältigung d. DNA/RNA, aber nicht d. Züchtung von Lebewesen.
Um transgene Zellen (Z. die ein fremdes Gen in ihr Genom aufgenommen haben) herzustellen zu können muss man:
1.Gewinnung des Gens: DNA-Abschnitt isolieren/synthetisiert werden
2.Transfer d. Gens: DNA-Abschnitt durch d. Zellgrenzmembran in die Zelle einschleusen
3.Vervielfältigung d. transgenen(t) Zellen: Die t. Zelle mit dem darin enthaltenen Fremd Gen muss vermehrt werden
4.Selektion transgener Zellen: Zellen, bei denen der Gentransfer gelungen ist, (fremde Gen aufgenommen) müssen erkannt und heraus gesucht werden
1.1Gewinnung eines Gens
Isolierung eines Gens aus der DANN eines Spenderorganismus
Hier bei sind d. wichtigsten Instr. d. Restriktionsenzyme. Die kann man in Bakterien findet, wo sie eingedrungene DNA von Bakteriophagen, das besondere Vieren zerschneiden u. damit unschädlich machen. V.a. solche Restiktionsenzyme, die d. DNA-Doppelstrang versetzt zerschneiden, sodass an den Schnittstellen je ein kurzes Stück Einzelstrang-DNA aus 4-6 Neukleotiden herausragt, spalten die DNA immer anstellen mit der gleichen, bestimmten Basenfolge, z.B. nach der Basensequenz AATT (Erkennungssequenz d. Reaktionsenzyms). Dadurch entstehen DNA-Stücke, deren überstehende Eintelsträngen die Abfolge AATT bzw. TTAA tragen (im komplementären Strang). Die Einzelstrang-Enden lagern sich wieder zusammen. Wegen den Paarung komplementärer Basen. Deswegen die Namensgebung „klebrige Enden“. Diese Methode ist die einfachste aber auch die ungenaueste → Schrotschuss-Methode, weil man eine Vielzahl verschiedener DNA-Stücken erhält. Das gewünschte DNA-Stück muss man in einen gesonderten Vorgang „herausgesucht“ werden.
>>Gene lassen sich durch Restriktionsenzyme aus dem DNA Molekühl herausschneiden.Umkopierung eines Gens von mRNA in DNA
Ein Gen lässt sich auch durch Umkopieren der entsprechenden mRNA herstellen. Benutzt wird dazu die mRNA aus Zellen die das gewünschte Genprodukt herstellen. Das Gen wird durch Transkription v. DNA auf mRNA umgeschrieben. Neben anderen mRNA-Strängen enthalten sie auch d. genetischen Information des Gewünschten Gens. Fürs umkopieren ist die reverse Transkriptase nötig (Enzym in Retroviren). Die gewünschte genetische Info. ist als RNA gespeichert. In den Wirtszellen sorgt das reverse Transkriptase, dass eine Transkription in umgekehrter (reverser) Richtung abläuft.
Folgende Durchführung:
1 mRNA wird aus den entsprechenden Zellen isoliert
2 nach Zugabe v. DNA-Nukleotiden wird der reverse Transkriptase komplementär zur mRNA ein DNA-Einzelstrang synthetisiert
3 Die mRNA wird von der DNA getrennt
4 Ergänzungen v. DNA-Einzelstränge DNA-Nukleotiden plementär zum Doppelstrang + DNA-Polymerase erforderlich → resultierende Doppelstrang = cDNA „copy DNA“
In den Zellen laüft nicht nur die ranskription eines einzigen Gens, sondern die Transkription aller gerade aktiver Gene ab. Es entsteht daher cDNA-Stücke mit dem verschiedenen genetischen Info. aller Aktiven Gene.
1.2 Transfer eines Gens
Um isoliertes Gen in eine Fremden Zelle einschleusen zu können muss es in der Regel an DNA-Stücke Gekoppelt werden, die von den Zellen leicht aufgenommen werden (Vektoren/„Genfähren“). Zielzellen sind häufig Bakterien, deren DNA als Bakterienchromosom (Ring) frei im Zytoplasma liegen. Die Plasmide sind kleine ringförmige DNA-Stücke, die sich neben einen fehlenden Zellkern sein können. Sie dienen als Vektoren für den Gentransfer benutzen.
1 Öffnung v. Plasmidringen im Regensglas mit den Restriktionsenzymen, das übertragen werden soll (die auch zur Isolierung des Gens dienten). Enden der Geöffneten Plasmide haben die komplementäre „klebrige enden“ wie die isolierten Gene. Falls die übertragenden Gene nicht mithilfe v. Restiktionsenzyme gewonnen werden, müssen in einem gesonderten Verfahren entsprechende klebrige enden angefügt werden.
2 Mischung d. isolierten Gene mit geöffneten Plasmidringen: Wenn sich komplementäre klebrigeenden finden, bildet sich zwei arten v. Plasmidringen, welche sich wieder geschlossen haben. Eine art enthält nur Bakterien-DNA, wenn sich d. Plasmidringen an der Öffnung stelle wieder schließen, die andere Bakterien-DNA +fremdes DANN-Stück. →rekombinante DNA. U.a. Hybridplasmide, das sind Mischplasmide, in denen Bakterien-DNA mit fremder DNA kombiniert ist.
3 mit DNA-Ligase(Enzym) verbinden sich die DNA - Stücke fest mit einander
4 Mischung d. Plasmide mit und ohne Fremdgen mit Bakterienzellen, die kein Plasmid enthalten.
5Behandeln der Bakterien mit Substanzen, d. ihre Wand für Plasmide leicht passierbar machen. Dadurch nehmen einige wenige Bakterienzellen in ihr Zytoplasma auf.
Plasmide lassen sich als Vektoren nutzen, wenn fremde Gene auf Bakterien übertragen werden sollen.
1.3 Vervielfältigung – Suche nach Bakterienzellen mit Hybridplasmiden
Im ersten Suchschnitt werden alle Zellen aussortiert, die Hybridplasmide sind und damit fremde DNA – Stücke aufgenommen haben.
Voraussetzungen für die Selektion
Für den transfer v. DNA – Stücke benutzt man Plasmide mit Resistenzgenen gegen Antibiotika z.B. Tetracyclin. Die Erkennungsregion des verwendeten Restriktionsenzyms muss innerhalb von Tetracyclin-Resistenz-Gens liegen. Solche Zellen sind Emun gegen Tetracyclin und Ampicicillin. Wenn das Plasmid aber fremde DNA aufnimmt bleiben die beiden Bereiche des Tetracyclin-Resistenz-Gens getrennt. Das Gen wird dadurch unwirksam, die Zelle verliert ihre Resistenz. Solche Zellen sind weiterhin empfindlich gegen Ampicillin, sie sterben aber bei Zugabe von Tetracyclin ab.
1.4 Selektion v. Zellen mit Hybridplasmid
Zuerst erfolgt eine Aussortierung der Bakterien, man bringt sie auf einen Ampicillin Nährboden. Die Bakterien, die ihr Genom durch die Aufnahme eines Plasmi8ds erweitert haben überleben.
Durch Resistenzgene in den Plasmiden können beim versuch der Genübertragung die wenigen Bakterien identifiziert werden, die tatsächlich ein Plasmid aufgenommen haben.
Bilder kommen noch dazu XD
In der Tetracyclin-Schale können sich aber nur Solche Bakterien vermehren und damit Kolonien bilden, die Plasmide aus reiner Bakterien-DNA enthalten. Ein Bakterium, das ein Hybridplasmid aufgenommen hat, besitzt ist nicht resistent. Weil fremd DNA das Tetracyclin – Resistenz – Gen des Plasmids in zwei getrennte Bereiche spaltet. Die Lücke im Kolonienmuster der Schale geben an welche Kolonien fremde DNA Aufgenommen haben.
Eine Genbank besteht aus verschiedenen Klonen, die jeweils eine andere fremde DNA in dem Plasmid enthalten, das sie aufgenommen haben.
Screening
Die suche nach Bakterienzellen mit Hybridplasmiden, die das gewünschte Fremdgen enthalten und nicht andere Abschnitte der Fremden DNA, geschieht mit Hilfe von
Gensonden.
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Übertragung des Koloniemusters einer Kulturschale auf ein Filterpapier. Dabei gelangt ein kleiner Teil der Zellen jeder Kolonie auf das Filterpapier, ähnlich wie bei der Stempel Technik
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Filterpapier wird behandelt, um die Bakterienzelle aufzubrechen, die DNA zu isolieren + Erhitzen um einständig zumachen.
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Zugabe v. Gensonde zum vorbehandelten Filterpapier.
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Auswaschen der Gensonde. Aus d. Bereich d. Filterpapiers, in denen sie durch H-Brücken an das Fremdgen gebunden ist.
5.Auflegen des Filterpapiers auf einen Röntgenfilm. An d. Stellen, an denen sich die Gensonde angelagert hat - das sind die Stücke der Bakterien-DNA, die das Fremdgen enthalten – schwärzt sich durch die radioaktive Strahlung der Film. Man bezeichnet ein solches verfahren als Autoradiografie.
- Durch Vergleichen des Filterpapiers mit dem Koloniemuster d. Kulturschale lässt sich die Kolonie ermitteln, die aus den gesuchten Bakterien besteht. Sie werden in frischem Nährmedium weiter vermehrt.
>>Mithilfe v. radioaktiven markierten Gensonden können in einer Genbank diejenigen Klone erkannt, die das Gen, das übertragen werden soll, in ihrem Plasmid enthalten.