Genbibliotheken enthalten große Stücke von entweder DNA oder cDNA aus z.B. Mauszellen in Vektoren. Da diese Vektoren aber winzig klein sind, können sie nicht von Hand oder durch Maschinen sortiert werden und z.B. mit Blutgerinnungsfaktor VIII Information beschriftet werden. Vielmehr werden diese Bibliotheken als Gemisch Millionen oder hundertausender Plasmide mit VERSCHIEDENEN Stücken genomischer DNA oder cDNA aufbewahrt.
Wie findet man jetzt aber das Plasmid, das man benötigt, heraus?
Sortiert wird, indem man mit dem Plasmidgemisch Bakterien transformiert: Eine Bakterienzelle nimmt eines dieser Plasmide auf und wächst auf einem Nährboden zu einer Kolonie heran. Millionen anderer Bakterien nehmen auch Plasmide, aber mit einem anderen Abschnitt der Maus-DNA, auf. Dadurch werden die Maus-DNA- oder Maus-cDNA-Stücke voneinander getrennt. Jetzt braucht man viele sehr große Platten und bekommt ein Abbild der Bibliothek auf diesen Platten. Um im Bild zu bleiben: Jede dieser Kolonien enthält ein Buch mit etwas anderer Information bzw. jede Kolonie enthält eine andere Maus-DNA.
Als nächstes muss jetzt die richtige Kolonie gesucht (engl.: screen = suchen) werden. Wir führen einen Screen durch.
In der Praxis hat sich auch ein etwas anderes Verfahren bewährt. Der Phage Lambda kann so verändert werden, dass er DNA noch in seinen Phagenkopf verpackt und bestimmte Bakterienzellen lysieren kann. Eine grosse Menge seiner Gene ist jedoch entfernt und kann mit Fremd-DNA ersetzt werden. Für die Verpackung sind Erkennungssequenzen nötig, die cos-Sequenzen. Fremd DNA kann zwischen die cos-Stellen eingefügt werden. Es entsteht ein Hybrid zwischen Lambda-DNA und Fremd DNA, das sich wie ein Plasmid in Standardbakterienzellen vermehren lässt. Allgemein nennt man ein Hybrid zwischen Plasmid und Phagen DNA Phagemid. In diesem speziellen Fall, wird die Konstruktion cosmid genannt.
Bakterien, die von den Phagen lysiert werden können, werden so dicht aneinander auf viele große Platten ausplattiert, dass die Bakterien dicht an dicht wachsen. Dies nennt man einen Rasen – beim Rasen stehen die Grashalme dicht an dicht.
Anstelle einer Transformation führt man jetzt eine Infektion mit Phagemiden oder Cosmiden durch und zwar mit sowenig Phagen, dass auf eine Platte nur einige hundert Phagen verteilt werden. Die Phagen lysieren die Zellen und vermehren dabei die Fremd-DNA stark (wie ihre eigene DNA). Der Phage befällt nach der Lyse wieder benachtbarte Zellen des Bakterienrasens. Da an der Stelle der Infektion die Zellen zerstört werden und die Phagen freigesetzt werden, wird diese Stelle auf der Platte ganz klar. Da nur wenige Phagen verwendet werden, ist an den meisten Stellen kein Phage vorhanden, die Zellen wachsen und bilden einen trüben Rasen. Auf diese Art und Weise entsteht nur einige hundert klare Löchern im trüben Rasen, genannt Plaques. Die Plaques lassen sich wie Kolonien nach der Fremd DNA durchsuchen (screenen).
2.4 Screening
Wonach wird eigentlich gesucht?
Das Suchen nach DNA muss mit einer Probe oder Sonde erfolgen. Die Probe muss markiert sein, z.B. radioaktiv und sie muss spezifisch die DNA erkennen. Dies geschieht über komplementäre Basenpaarung. Die Probe ist also markiert, einzelsträngig und komplementär zu der Fremd-DNA, die wir klonieren möchten.
Die Kolonien oder die Plaques werden auf ein Filter übertragen, es entsteht eine Kopie der Kolonien oder der Plaques auf dem Filter. Man muss sich dabei merken, welcher Punkt auf dem Filter welcher Kolonie entspricht. Dazu kann man den Filter einfach auf die Platte auflegen und ein paar mal mit einer Nadel am Rand durch Filter und Plattenagar stechen. So kann man später genau sagen, welche Kolonie die gewünschte DNA enthält (siehe unten).
Die DNA auf dem Filter wird zu Einzelsträngen denaturiert und auf dem Filter fixiert – d.h. chemisch gebunden, die Probe wird dazugegeben und es kann sich eine komplementäre Basenpaarung zwischen der DNA auf dem Filter und der Probe einstellen, es entsteht ein Hybrid (griech.: verschiedener Ursprung) aus Filter-DNA und Proben DNA. Deshalb nennt man diese Technik Hybridisierung. Unspezifisch gebundene Probe wird anschließend ausgewaschen.
Wird jetzt ein Film auf den gewaschenen Filter aufgelegt, schwärzt die Probe (radioaktiv markiert) den Film an den Stellen, an denen sie spezifisch gebunden ist. Auch an der Löchern der Nadelstiche bleibt ein wenig Probe unspezifisch hängen. Noch cleverer ist es, zum Stechen ein wenig radioaktiver Tinte zu verwenden. Jetzt kann man den Film unter die Platte legen und die schwarzen Stellen mit einer Kolonie oder Plaques zur Deckung bringen. Die Kolonie, die auf dem Film schwarz erscheint, enthält die gesuchte DNA.
Endlich kann man z.B. das Cosmid aus dem Plaque reinigen und in Bakterien, die nicht lysiert werden, weitervermehren.
Zu Frage 2:
Bei Genbibliotheken geht es zunächst meistens darum, die Gensequenz (von der man nur einen Teil kennt) vollständig zu erhalten, und dann damit alles mögliche anzustellen. Z.B. Mutationen festzustellen, den Kontext (weitere Gene links oder rechts) zu erforschen, Informationen über nicht-codierende Bereiche zu erhalten und natürlich auch, das Gen heterolog zu exprimieren, wie von dir beschrieben.
