Genbibliothek - wie funktioniert das?

Ich hab das Prinzip der Genbib. noch nicht ganz verstanden. was vor allem an den undeutlich geschriebenen texten bei wikipedia und auch einigen büchern liegt.

ich erkläre mal wie ichs verstanden hab und ihr berichtigt mich wenn nötig:

das haploide genom zb von arabidopsis ist in dna-abschnitte geschnitten und jedes dieser abschnitte wird in einen vektor, zb plasmid, kloniert.

mir ist unklar wie das genau sein soll… angenommen man hat 25000 dna-abschnitte und will daraus ne bib anlegen. muss man jetzt 25000 plasmide haben und jedes genau 1 gen aufnehmen oder liegen alle 25000 plasmide in einem e.coli vor? weil falls man die 25000 gene auf mehrere in e.coli integrierte plasmide verteilen würde, könnten die ja rekombinieren via sexpili etc.
also das erscheint mir unlogisch.

wie geht das?

  1. sehe ich das richtig, dass man eine genbib vor allem deswegen braucht, wenn man ein bekanntes gen (und dann protein) in industriellen mengen herstellen will und man eben das plasmid mit hybridisierung aussucht, in dem das gesuchte gen steckt und dieses plasmid dann isoliert und in ein e.coli zur exponentiellen produktion des proteins transformiert?

richtig? oder gibt es sonst noch irgendwelche nutzen solch einer genbib?

Hi Joyner,

lang, lang ist’s bei mir her mit den Labortagen, aber ich will’s mal versuchen zu erklären.
Angenommen, Du hast 25.000 Plasmide, die Genschnipsel enthalten, also Deine Bib.
Die schiesst Du z.B. in 10^9 (1 Milliarde) E. Colis, d.h. jedes Plasmid ist statistisch in 40.000 E. Colis enthalten (1.000.000.000 / 25.0000 = 40.000). Manche enthalten mehr Plasmide, manche gar keines, aber das macht aufgrund der großen Anzahl von E. Colis nichts. Irgendein paar Colis werden das Plasmid mit „Deinem Gen“ schon enthalten. Natürlich können die per Pili kopulieren und Gene austauschen, aber das kannst Du vernachlässigen. Schließlich pickst Du nach einer kurzen Wachstumsphase *die* E. Coli-Kolonie raus, die „Dein Gen“ enthält (dafür gibt es verschiedene Identifikationsverfahren). Diese E. Coli-Kolonie vermehrst Du weiter und kannst Unsummen von Plasmiden mit Deinem Gen erstellen, z.B., um es zu sequenzieren oder daraus in vitro ein Protein herzustellen.

Ich hoffe, ich konnte Licht ins Dunkle bringen.

Gruß,

Ivo

hi,

aber wie kann ich eine kolonie herstellen, die nur aus ein und dem selben e.coli stammt?

und 2. wegen dem sequenzieren: wieso sollte man ein gen verfielfältigen um es zu sequenzieren, wenn man es doch vorher schon mit einer gensonde identifizieren muss und daher die sequenz der gensonde bekannt sein muss?

(1) Das ist klassische Mikrobio. Du gehst mit einer Öse in eine Kolonie, annehmend, dass es überwiegend Klone sind. Die Öst tunkst Du in eine Lösung, verdünnst sie und streichst diese auf einer frischen Agar-Platte aus. Die Kolonien, die dann entstehen, entstammen aus einem Bakterium, sind Klone.

(2) Manchmal kennt man nur einen Teil der Gensequenz. Mit diesem Teil kannst Du Dein Plasmid identifizieren. Das Plasmid enthält dann mehr als die bekannte Gensequenz, möglichweise auch Steuersequenzen wie Promotoren oder ähnliches. Aber genau weiß ich das auch nicht mehr, ich habe mein molekularbiologisches Herz an die IT verkauft, bin zu lange draußen :wink:

hi,

bei 1. klar das weiß ich, aber ich wollte eben wissen, woher klar ist, dass in einer kolonie von vornherein klone sind und nicht eine wilde mischung als vielen tausend verschiedenen ecolis vorliegt

Hallo,

zu 1: es gibt dann 25000 verschiedene Vektoren mit je einem DNA-Abschnitt.Und je ein Klon trägt ein Plasmid. Dann werden die Klone voneinander isoliert . so kann da nichts rekombinieren. Kann es sowieso nicht, weil zum einen rec- Stämme verwendet werden. Denen fehlt das Gen für Rekombinase. Und zum zweiten diese Stämme hfr- Stämme sind, also kein F-Plasmid besitzen. Der Vektor, der die Gen-Bib trägt, ist natürlich auch kein F-Plasmid.

zu 2: so ist es. Zweck 1) Gen-Protein-Zuordnung.
2) Aufklärung von Stoffwechselwegen
3) Genomsequenzierung (nur bedingt möglich, falls keine repetetiven Sequenzen vorliegen)

diese antwort ist stark!

Hallo

„das haploide genom zb von arabidopsis ist in dna-abschnitte geschnitten und jedes dieser abschnitte wird in einen vektor, zb plasmid, kloniert.“

egal ob haploid oder diploid, praktisch gesehen nimmt man einfach ein Totalextrakt und kloniert das.

„angenommen man hat 25000 dna-abschnitte und will daraus ne bib anlegen. muss man jetzt 25000 plasmide haben und jedes genau 1 gen aufnehmen oder liegen alle 25000 plasmide in einem e.coli vor?“

Bei der Transformation in E. coli ist es so, dass nur eine von vielleicht 100’000 Zellen überhaupt ein Plasmid aufnimmt. Meist nur eines, in seltensten Fällen 2 oder so, das ist aber unerwünscht.
Dann wird die ganze Suppe ausplattiert und mit Antibiotikaselektion wachsen nur die Kolonien, die ein Plasmid enthalten.

„weil falls man die 25000 gene auf mehrere in e.coli integrierte plasmide verteilen würde, könnten die ja rekombinieren via sexpili etc.“
Das werden sie nicht tun, solange sie auf einer Platte wachsen. Flüssigkulturen werden erst von den einzelnen Klonen (d.h. 1 Plasmid in einer E. coli-Kolonie) angelegt.

„Sehe ich das richtig, dass man eine genbib vor allem deswegen braucht, wenn man ein bekanntes gen (und dann protein) in industriellen mengen herstellen will und man eben das plasmid mit hybridisierung aussucht, in dem das gesuchte gen steckt und dieses plasmid dann isoliert und in ein e.coli zur exponentiellen produktion des proteins transformiert?“

Bibliotheken (Libraries) werden zu ganz verschiedenen Zwecken angelegt.
Erstens mal zum Sequenzieren eines ganzen Genoms.

Dann häufig cDNA-Bibliotheken, das sind die revers transkribierten mRNAs, wenn man nur an den codierenden Elementen interessiert ist. Das wird sehr häufig zu Funktionsstudien gemacht. Yeast two hybrid ist eine Methode für Interaktionsstudien, die man häufig mit cDNA-Bibliotheken macht.

Früher hat man Klone/Gene noch mit Hybridisation identifiziert, richtig. Wie das heute ist weiss ich auch nicht mehr, bin schon zu lange aus dem Labor.

Wenn man dann ein Gen/Protein und dessen Funktion genauer untersucht, arbeitet man kaum mehr mit Bibliotheken, sondern nur noch mit dem einen Klon der dein „gene of interest“ enthält, das würde dann in deinem Beispiel auch verwendet um ein Protein in grösseren Mengen zu produzieren. Denn wenn man an dem Punkt angelangt ist, dass man den industriellen Nutzen eines Proteins erkannt hat, wurde es meist schon länger im Labor auf seine Funktion erforscht…

hoffe das hilft

Hallo Joyner,

Ich habe gerade selber noch einmal im Buch „Molekulare Genetik“ von Rolf Knippers (9. Auflage) nachgelesen. Der Abschnitt zu Genombibliotheken ist sehr ausführlich und auch gut verständlich geschrieben. Das schon einmal als Literaturtipp im Voraus.

Hier kommt kurz die Zusammenfassung.

  1. Wie werden die Bibliotheken hergestellt?
  2. Wie werden die Bibliotheken verwendet?

Zu 1.
Genombibliotheken werden hergestellt, in dem das Genom mittels eines spezifischen Restriktionsenzyms verdaut wird. Dabei ergiebt sich die Größe der Fragmente aus der rein zufälligen Verteilung der Restriktionsschnittstellen, liegt im Mittel aber bei 1/4^n, wobei n die Länge der spezifisch erkannten Sequenz ist. (Bsp.: Erkennt das Enzym ein Pentanucleotid, ist die mittlere Fragmentlänge 4^5 = 2^10 = 1024.) Selbstverständlich repräsentiert ein DNA-Fragment nicht jeweils ein Gen (besonders nicht bei Insertion in Plasmide!), sondern eben nur ein zufälliges Genomfragment. Anzumerken ist, dass durch die Verwendung des spezifischen Restriktionsenzyms die Genombibliothek zuverlässig reproduziert werden kann!
Handelt es sich um eine cDNA-Bibliothek, dann sind die Fragmente bereits in Form von mRNA vorhanden und müssen eben nur in cDNA übersetzt werden.
In beiden Fällen, der Genom- als auch der cDNA-Bibliothek müssen die Fragmente z.B. in Plasmide eingebaut werden. Die Klonierungsverfahren sind dabei meist so spezifisch, dass in der Regel nur ein Insert je Vektor eingebaut wird. Das wird z.B. über die Verwendung angehängter Restriktionsschnittstellen oder durch Topo-Cloning (siehe Buch oder Internet) erreicht.
Die Plasmide werden dann in einen Überschuss an Bakterien transfomiert. Da mehr Bakterien als Plasmide vorhanden sind, erhält ein Bakterium in der Regel nur ein Plasmid.
Damit es nicht zum Plasmidtransfer zwischen den Bakterien kommt, fehlt den Plasmiden der „oriT“, der Replikationsursprung, der für die Transfer-Replikation in andere Bakterien erforderlich wäre. Bakterien können die Plasmide also nicht austauschen!
Damit es eine echte Bibliothek wird, müssen die Bakterien vereinzelt werden. Dafür werden die Bakterien z.B. auf Agarplatten kultiviert. Jedes vereinzelte Bakterium erzeugt eine Kolonie von vielen Kopien ein- und desselben Bakterium (von „Klonen“), daher der Name der Prozedur: Klonieren.

Zu 2.
Wie findet man ein spezifisches Fragment in einer cDNA-Bibliothek? – Nur mit sehr viel Aufwand!
Ein Gen oder eine cDNA repräsentiert in der Regel ein Protein. Um zu einem Protein die entsprechende cDNA oder später das Gen in einer Bibliothek zu finden, ist entweder ein Antikörper gegen das Zielprotein oder eine zumindest teilweise Kenntnis der Peptidsequenz erforderlich. Im letzteren Fall muss auf Basis der bekannten Peptidsequenz ein Set aus Oligonucleotiden erstellt werden, gemeinsam gegen alle denkbaren Sequenzen der codierenden mRNA gerichtet sind. (Eine Aminosäure kann ja durch verschiedene Codons kodiert werden, als müssen alle denkbaren Varianten abgedeckt werden.)
Dann wird von den Agarplatten der cDNA-Bibliothek ein Abdruck auf Nitrocellulose-Filter (kennt man von Western Blots) erzeugt.
Die Filter werden mit den Sonden (Antikörper oder Oligonucleotide) inkubiert. Die so auf Filter markierten Stellen werden dann mit den Agarplatten verglichen. Je nachdem, wie gut die Sonden sind, repräsentiert jede markierte Stelle auf einem Filter eine Bakterienkolonie, die die cDNA (oder einen Teil der cDNA) zum gesuchten Protein trägt.
Die entsprechende Kolonie kann dann mit üblichen mikro-/molekularbiologischen Methoden vervielfältigt und die Plasmide aufgereinigt werden.
Mit Fragmenten der vervielfältigten cDNA kann dann die genomische Bibliothek nach der eben beschriebenen Methode nach den entsprechenden genomischen Fragmenten durchsucht werden.
Sehr viel einfacher gestaltet sich die Verwendung der Bibliotheken, sollen die Fragmente einfach nur sequenziert werden. Dann muss einfach ein Bakterienklon nach dem anderen abgearbeitet werden. Hier besteht der Nutzen der Bibliothek einfach nur darin, dass man distinkte DNA-Fragmente hat und molekularbiologisch „greifen“ kann.

In Zeiten vollständig sequenzierter Genome würde man sicher keine cDNA- oder Genombibliothek mehr anlegen, wenn man das Gen oder insbesondere einfach nur die cDNA zu einem spezifischen Protein in die Hände bekommen möchte.
In unserem Labor schaut man sich zuerst das Zielprotein an. Dann werden online-Datenbanken nach der codierenden mRNA durchsucht. Auf Basis der online recherchierten mRNA-Sequenz werden dann PCR-Primer ausgewählt, mit die entsprechende cDNA aus einem Gemisch von cDNAs (keiner Bibliothek!) dann mittels PCR amplifiziert werden. Die Klonierung dieser cDNA erfolgt dann meist über Topo-Cloning.
Die Notwendigkeit der Bibliothek ergibt sich in der Regel also nur, wenn das Genom des entsprechenden Organismus noch nicht vollständig sequenziert vorliegt.

Hoffe, die Erklärung war einigermaßen hilfreich. Ich glaube, alle Fragen sind beantwortet. An sonst verweise ich noch einmal auf die deutlich ausführlichere Erklärung im Knippers.

Grüße,
Theodoric.

danke dir.

welche vorteile hat dieses topo-klonieren gegenüber dem üblichen klonieren auf bakterielle plasmide?

ist heute fast nur noch das topo-klonieren in den labors gängig? man spart sich wohl zzeit da der verdau und ligation wegfällt. hat es noch andere vor und nachteile?

reHallo,

Richtig: das Topo-Klonieren spart den Restriktionsverdau, (anschließende Geleelektrophorese und Extraktion!) und die Ligation. Wobei insbesondere der Restriktionsverdau und die Aufreinigung zeitaufwendig, relativ arbeitsintensiv und auch fehleranfällig sind: Man kann dem PCR Fragment auf dem Gelphoto nicht ansehen, ob es erfolgreich geschnitten wurde, da ihm ja nur ein paar Basenpaare fehlen!
Oftmals benutzen wir das sehr zuverlässige Topo-Klonieren damit als Zwischenschritt: Erst einmal das PCR-Produkt in einen Topo-Vektor bringen. Dann kann man das Plasmid in Bakterien vervielfältigen und aufreinigen (mini oder midi). Damit kann ein reguläres Cut&amp:stuck_out_tongue_winking_eye:aste-Cloning gemacht werden. Die Enzyme schneiden im Plasmid besser als im PCR-Fragment. Und zudem lässt sich der Restriktionsverdau besser überprüfen!

Kurzes Zeitvergleich:

Topo-Cloning:

PCR (ca. 2h)
Aufreinigung über Säule (ca. 15min)
Insertion in TOPO (ca. 15min)
Transformation (ca. 1h)

Total: 3,5h

PCR>Cut&gt:stuck_out_tongue_winking_eye:aste

PCR (ca. 2h)
[ggf. Aufreinigung über Säule (ca. 15min)]
Verdau (ca. 15min bis 1h; fehleranfällig und schwer überprüfpbar)
Aufreinigung über Säule (ca. 15min) oder Gel (ca. 30min-1h) > Gelextraktion (ca. 30min)
Ligation (abhängig von Ligase ca. 20min-1h; je nach Qualität der Aufreinigung mehr oder weniger fehleranfällig und ebenfalls schwer überprüfbar)
Transformation (ca. 1h)

Total: ca. 3h50min - 6h45min(!)

Grüße!

Nachtrag:

Der vielleicht wichtigste Vorteil des Topo-Klonierens, gerade im Blick auf die Bibliotheken:
Du benötigst natürlich auch gar nicht erst das Vorhandensein einer Restriktionsschnittstelle. Also benötigt mus man im Falle e.g. der cDNA-Bibliotheken die DNA-Fragmente nicht erst mit einem Tag (der eine Restriktionsschnittstelle trägt) versehen und im Falle des Klonierens mittels PCR aus cDNA oder dem Genom heraus kann man ebenfalls Primer ohne Flap (wieder die Restriktionsschnittstelle) verwenden, wodurch die PCR spezifischer wird!

Dagegen glaube ich aber nicht, dass Topo-Klonieren die einzige, verwendete Methode ist. Der Nachteil ist halt, dass man für viele Anwendungen oft nur ein Zwischenprodukt erhält. Abhängig von der Anwendung kann es also zweckmäßig sein, sich gleich dem aufwendigen Protokoll zu stellen.

Hi,

sorry bin schon ziemlich lange aus dem Thema.

kann Dir da leider keine detalierte Antwort geben.

Gruß Heiko

Hallo,

etwas spät aber hier eine Antwort:

das haploide genom zb von arabidopsis ist in dna-abschnitte
geschnitten und jedes dieser abschnitte wird in einen vektor,
zb plasmid, kloniert.

Das Genom wird durch Restriktionsenzyme in viele beliebeige Stücke zerlegt. Jedes dieser Stücke kann ein oder meist mehrere Gene enthalten. Jedes einzelne Stück muss in einen Vektor kloniert werden. Das geht auch in Massenansätzen zB in Phagen.

mir ist unklar wie das genau sein soll… angenommen man hat
25000 dna-abschnitte und will daraus ne bib anlegen. muss man
jetzt 25000 plasmide haben und jedes genau 1 gen aufnehmen
oder liegen alle 25000 plasmide in einem e.coli vor? weil
falls man die 25000 gene auf mehrere in e.coli integrierte
plasmide verteilen würde, könnten die ja rekombinieren via
sexpili etc.
also das erscheint mir unlogisch.

Die klonierten Abschnitte können jetzt in zB E. coli transfiziert oder via Phagen infiziert werden. Im Prinzip je Abschnitt ein E.coli. Dann kann mann ein Screening durch führen.

  1. sehe ich das richtig, dass man eine genbib vor allem
    deswegen braucht, wenn man ein bekanntes gen (und dann
    protein) in industriellen mengen herstellen will und man eben
    das plasmid mit hybridisierung aussucht, in dem das gesuchte
    gen steckt und dieses plasmid dann isoliert und in ein e.coli
    zur exponentiellen produktion des proteins transformiert?

Eigentlich geht es nicht um eine industrielle Nutzung. Da würde man eher das spezifische Gen isolieren und über Vektoren in E. coli überführen, um die dann in Fermentern zu vervielfältigen und die Proteine zu ernten.
Genbanken sind eher so etwas wie Datenbanken für Gene. Mann kann damit das gesammte Genom eines Organismus in einer Form speichern, dass man die Gene auch wieder ablesen kann. Damit stellen sie zB auch eine Speichermöglichkeit für die Genome vom Aussterben bedrohter Arten da.

Beste Grüße

Marcus Wirth

Genbibliotheken enthalten große Stücke von entweder DNA oder cDNA aus z.B. Mauszellen in Vektoren. Da diese Vektoren aber winzig klein sind, können sie nicht von Hand oder durch Maschinen sortiert werden und z.B. mit Blutgerinnungsfaktor VIII Information beschriftet werden. Vielmehr werden diese Bibliotheken als Gemisch Millionen oder hundertausender Plasmide mit VERSCHIEDENEN Stücken genomischer DNA oder cDNA aufbewahrt.
Wie findet man jetzt aber das Plasmid, das man benötigt, heraus?

Sortiert wird, indem man mit dem Plasmidgemisch Bakterien transformiert: Eine Bakterienzelle nimmt eines dieser Plasmide auf und wächst auf einem Nährboden zu einer Kolonie heran. Millionen anderer Bakterien nehmen auch Plasmide, aber mit einem anderen Abschnitt der Maus-DNA, auf. Dadurch werden die Maus-DNA- oder Maus-cDNA-Stücke voneinander getrennt. Jetzt braucht man viele sehr große Platten und bekommt ein Abbild der Bibliothek auf diesen Platten. Um im Bild zu bleiben: Jede dieser Kolonien enthält ein Buch mit etwas anderer Information bzw. jede Kolonie enthält eine andere Maus-DNA.
Als nächstes muss jetzt die richtige Kolonie gesucht (engl.: screen = suchen) werden. Wir führen einen Screen durch.

In der Praxis hat sich auch ein etwas anderes Verfahren bewährt. Der Phage Lambda kann so verändert werden, dass er DNA noch in seinen Phagenkopf verpackt und bestimmte Bakterienzellen lysieren kann. Eine grosse Menge seiner Gene ist jedoch entfernt und kann mit Fremd-DNA ersetzt werden. Für die Verpackung sind Erkennungssequenzen nötig, die cos-Sequenzen. Fremd DNA kann zwischen die cos-Stellen eingefügt werden. Es entsteht ein Hybrid zwischen Lambda-DNA und Fremd DNA, das sich wie ein Plasmid in Standardbakterienzellen vermehren lässt. Allgemein nennt man ein Hybrid zwischen Plasmid und Phagen DNA Phagemid. In diesem speziellen Fall, wird die Konstruktion cosmid genannt.

Bakterien, die von den Phagen lysiert werden können, werden so dicht aneinander auf viele große Platten ausplattiert, dass die Bakterien dicht an dicht wachsen. Dies nennt man einen Rasen – beim Rasen stehen die Grashalme dicht an dicht.
Anstelle einer Transformation führt man jetzt eine Infektion mit Phagemiden oder Cosmiden durch und zwar mit sowenig Phagen, dass auf eine Platte nur einige hundert Phagen verteilt werden. Die Phagen lysieren die Zellen und vermehren dabei die Fremd-DNA stark (wie ihre eigene DNA). Der Phage befällt nach der Lyse wieder benachtbarte Zellen des Bakterienrasens. Da an der Stelle der Infektion die Zellen zerstört werden und die Phagen freigesetzt werden, wird diese Stelle auf der Platte ganz klar. Da nur wenige Phagen verwendet werden, ist an den meisten Stellen kein Phage vorhanden, die Zellen wachsen und bilden einen trüben Rasen. Auf diese Art und Weise entsteht nur einige hundert klare Löchern im trüben Rasen, genannt Plaques. Die Plaques lassen sich wie Kolonien nach der Fremd DNA durchsuchen (screenen).

2.4 Screening

Wonach wird eigentlich gesucht?

Das Suchen nach DNA muss mit einer Probe oder Sonde erfolgen. Die Probe muss markiert sein, z.B. radioaktiv und sie muss spezifisch die DNA erkennen. Dies geschieht über komplementäre Basenpaarung. Die Probe ist also markiert, einzelsträngig und komplementär zu der Fremd-DNA, die wir klonieren möchten.
Die Kolonien oder die Plaques werden auf ein Filter übertragen, es entsteht eine Kopie der Kolonien oder der Plaques auf dem Filter. Man muss sich dabei merken, welcher Punkt auf dem Filter welcher Kolonie entspricht. Dazu kann man den Filter einfach auf die Platte auflegen und ein paar mal mit einer Nadel am Rand durch Filter und Plattenagar stechen. So kann man später genau sagen, welche Kolonie die gewünschte DNA enthält (siehe unten).
Die DNA auf dem Filter wird zu Einzelsträngen denaturiert und auf dem Filter fixiert – d.h. chemisch gebunden, die Probe wird dazugegeben und es kann sich eine komplementäre Basenpaarung zwischen der DNA auf dem Filter und der Probe einstellen, es entsteht ein Hybrid (griech.: verschiedener Ursprung) aus Filter-DNA und Proben DNA. Deshalb nennt man diese Technik Hybridisierung. Unspezifisch gebundene Probe wird anschließend ausgewaschen.
Wird jetzt ein Film auf den gewaschenen Filter aufgelegt, schwärzt die Probe (radioaktiv markiert) den Film an den Stellen, an denen sie spezifisch gebunden ist. Auch an der Löchern der Nadelstiche bleibt ein wenig Probe unspezifisch hängen. Noch cleverer ist es, zum Stechen ein wenig radioaktiver Tinte zu verwenden. Jetzt kann man den Film unter die Platte legen und die schwarzen Stellen mit einer Kolonie oder Plaques zur Deckung bringen. Die Kolonie, die auf dem Film schwarz erscheint, enthält die gesuchte DNA.
Endlich kann man z.B. das Cosmid aus dem Plaque reinigen und in Bakterien, die nicht lysiert werden, weitervermehren.

Zu Frage 2:
Bei Genbibliotheken geht es zunächst meistens darum, die Gensequenz (von der man nur einen Teil kennt) vollständig zu erhalten, und dann damit alles mögliche anzustellen. Z.B. Mutationen festzustellen, den Kontext (weitere Gene links oder rechts) zu erforschen, Informationen über nicht-codierende Bereiche zu erhalten und natürlich auch, das Gen heterolog zu exprimieren, wie von dir beschrieben.

Servus,

Ich hab das Prinzip der Genbib. noch nicht ganz verstanden.
was vor allem an den undeutlich geschriebenen texten bei
wikipedia und auch einigen büchern liegt.

ich erkläre mal wie ichs verstanden hab und ihr berichtigt
mich wenn nötig:

das haploide genom zb von arabidopsis ist in dna-abschnitte
geschnitten und jedes dieser abschnitte wird in einen vektor,
zb plasmid, kloniert.

mir ist unklar wie das genau sein soll… angenommen man hat
25000 dna-abschnitte und will daraus ne bib anlegen. muss man
jetzt 25000 plasmide haben und jedes genau 1 gen aufnehmen
oder liegen alle 25000 plasmide in einem e.coli vor? weil
falls man die 25000 gene auf mehrere in e.coli integrierte
plasmide verteilen würde, könnten die ja rekombinieren via
sexpili etc.
also das erscheint mir unlogisch.

Durch Verdünnung wird erreicht, dass pro Kolonie nur ein Plasmid vorliegen sollte. Phagen sind da übrigens etwas dankbarer, da sie nur eine bestimmte Menge DNA einbauen können.

Der Sinn des Einbaus in Vektoren (wie z.B. Plasmide) ist jedenfalls die Vermehrung, so dass genug Material vorliegt, welches dann isoliert und sequenziert werden kann.

In jedem Fall werden immer nur Fragmente vervielfältigt, deren Größe vom verwendeten Vektor abhängt (YACs und BACs sind hierbei gegenüber von Plasmiden von Vorteil, weil sie die Vervielfältigung recht großer Abschnitte erlauben).

Diese Fragmente müssen nach der Sequenzierung dann wieder zusammengesetzt werden (im Computer), wobei vor allem sich wiederholende Seqeunzbereiche ein Problem darstellen. Dabei helfen auch molekularbiologische Markierungsmethoden, die die (ungefähre) Position des Abschnitts im Genom verraten.

  1. sehe ich das richtig, dass man eine genbib vor allem
    deswegen braucht, wenn man ein bekanntes gen (und dann
    protein) in industriellen mengen herstellen will und man eben
    das plasmid mit hybridisierung aussucht, in dem das gesuchte
    gen steckt und dieses plasmid dann isoliert und in ein e.coli
    zur exponentiellen produktion des proteins transformiert?

richtig? oder gibt es sonst noch irgendwelche nutzen solch
einer genbib?

Immer wenn man für einen Versuch einen speziellen Genabschnitt finden will, ist eine GenBib von Vorteil.

Also nicht nur industrielle Anwendungen, sondern auch Grundlagenforschung.

Gruß,
Sax