Auf „http://www.zum.de/Faecher/Materialien/hupfeld/index…“ ist zu lesen, dass wenn nur wenig DNA-MAterial für einen Fingerprint vorhanden ist im Anschluss an die Gelelektrophorese eine Southern Blot nötig ist um die BAnden sichtbar zu machen.
Wenn jedoch viel DNA-Material vorhanden ist, sei dies nicht notwendig.
Meine Frage hierzu: Wie werden die BAnden im GEl dann sichtbar gemacht?
a) Wird die DNA einfgach angefärbt? (Womit? Und wie wird hier dann sichergestellt, dass man keinen „Schmier-Film“ sondern nur die BAnden bekommt, die einen interessieren?
b) mit Sonden? (wie kommen die dann in das Gel?)
Wenn jedoch viel DNA-Material vorhanden ist, sei dies nicht
notwendig.
Meine Frage hierzu: Wie werden die BAnden im GEl dann sichtbar
gemacht?
a) Wird die DNA einfgach angefärbt? (Womit? Und wie wird hier
dann sichergestellt, dass man keinen „Schmier-Film“ sondern
nur die BAnden bekommt, die einen interessieren?
Ich vermute, dass man das nach der Standardmethode macht: Im Laufpuffer und im Gel befindet sich Ethidiumbromid. Diese Substanz lagert sich unspezifisch an DNA an und fluoresziert unter UV-Bestrahlung orange.
Bei der STR-Methode kann es keinen Schmier geben, da nur die gesuchten Banden durch die PCR amplifiziert werden. Bei der RFLP-Methode bin ich mir da nicht so sicher…
b) mit Sonden? (wie kommen die dann in das Gel?)
Sonden kann man nur verwenden, wenn man die DNA vorher geblottet hat.
Meine Frage hierzu: Wie werden die BAnden im GEl dann sichtbar
gemacht?
Man macht eine multiplex-PCR für einen ausgewählten Satz an Polymorhismen. Die Primer sind von Anfang an mit einem Flureszenzfarbstoff markiert (da gibt es viele in untersch. Farben: FAM, JOE, HEX, TAMRA, CY3, CY5, …). Trennt man die PCR-Produkte auf, kann man anhand der Banden-Farben erkennen, welcher Polymorphismus das ist. Heute macht man das aber nicht mehr in normalen Gelen, sondern in Kapillaren. Die enthalten ein „lineares Polymer“, und wegen der winzigen Querschnittsfläche kann man da mit großen Spannungen (kV-Bereich) arbeiten und so kurze Trennzeiten bei sehr großen Trennstrecken (bis 50cm) erreichen, was eine super Trennschärfe ergibt. Am Ende der Kapillare ist ein Laser und ein Photosensor, und gemessen wird praktisch nicht mehr die Laufstrecke bei vorgegebener Zeit, sondern die Zeit, die eine Bande braucht, um den Detektor zu erreichen.