Hallo,
Das Prinzip:
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Man isoliert (irgendwie) die Sequenz eines Zielgens (zB. des Humaninsulingens).
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Man isoliert (irgendwie) Plasmide aus Bakterien.
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Man schneidet sowohl das Zielgen als auch die Plasmide mit einem Restriktionsenzym (dazu unten mehr!).
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Man gibt die geschnittenen Plasmide und die geschnittenen Zielsequenzen zusammen und „verklebt“ sie mit einer Ligase.
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Die so entstandendn neuen Plasmide enthalten das Zielgen. Sie werden dann (irgendwie) wieder in Bakterien eingeschleußt.
Also, zu Punkt 3:
Man will ja, dass später das Zielgen in das Plasmid integriert wird. Und zwar an einer bestimmten Stelle, in einer bestimmten Orientierung und genau einmal.
Stell dir vor, Du machst das alles mit Papierstreifen. Du hast also einige Milliarden „rote“ Papierstreifen (geschnittene, also linearisierte Plasmide; bevor sie geschnitten wurden ware es also rote Papierstreifenringe) und einige Milliarden „blaue“ Papierstreifen (Zielgen). Die rührst Du zusammen in einem Topf, worin ein Enzym, die Ligase, dafür sorgt, dass freie Papierstreifenenden miteinander verklebt werden. Was kommt raus?
Genau, ein Wust an langen, bunten Papierstreifenketten, die meisten wahrscheinlich zu mehr oder weniger großen Ringen geschlossen. Eigentlich willst du aber Ringe, die aus genau zwei Streifen zusammengesetzt wurden, und zwar dem roten und dem blauen. Außerdem ist auch noch wünschenswert, dass der blaue Streifen richtig herum im roten Streifen sitzt. Wie kann man all das erreichen?
Das Klebe-Enzym, die Ligase, erkennt zueinander passende Enden der Streifen. Wenn du die Streifen also nicht stumpf schneidest, sondern so, dass die Schnittkante ein bestimmtes Muster bildet, kannst du die Muster so wählen, dass beim verkleben genau immer nur ein blauer und ein roter Streifen in der richtigen Weise verklebt werden.
Auf der DNA geschieht das Schneiden mit sog. Restriktionsenzymen. Diese Enzyme erkennen eine ganz bestimmte sequenz und schneiden die DNA dort. Die meisten R.enzyme schneiden dabei nicht einfach stumpf durch, sondern sie schneiden die beiden Stränge etwas versetzt:
NNNNNACGTNNNNN -\> NNNNNACG TNNNNN
NNNNNACGTNNNNN NNNNNA GCTNNNNN
(N steht für ein beliebiges Nukleotid; die Erkennungssequenz wäre hier zB. ACGT).
Die entstehenden Bruchstücke haben Überhänge, die wechselseitig komplementär sind. unter geeigneten Bedingungen finden sich solche Enden schnell wieder zusammen und bleiben praktisch aneinander kleben. Daher nennt man sowas „sticky ends“. Wenn dann noch Ligase zugegen ist, werden die Bruchstücke wieder chemisch verbunden (ligiert).
Nun kannst du sowohl das Plasmid als auch das Zielgen mit zwei verschiedenen R.enzymen gleichzeitig schneiden, so dass auf beiden Seiten unterschiedliche „sticky ends“ entstehen, wobei das linke Ende des Zielgens zum rechten Ende des Plasmids passt und umgekehrt:
NNCCGGNN-Plasmid-NNACGTNN -\> NNCC NN-Plasmid-NNACG TNN
NNGGCCNN-Plasmid-NNTGCANN NN GGNN-Plasmid-NNT GCANN
NNACTGNN-Gen-NNCCGGNN -\> NNACG TNN-Gen-NNCC NN
NNTAGCNN-Gen-NNGGCCNN NNT GCANN-Gen-NN GGNN
Wenn man das mischt, können ein Plasmid und ein Gen einen wunderschönen Ring bilden. Zwei Plasmide ohne Gen zB. können keinen Ring bilden. Auch Gene ohne Plasmid nicht.
NN-Plasmid-NNACG TNN-Gen-NNCC -\> NN-Plasmid-NNACGTNN-Gen-NNCC
GGNN-Plasmid-NNT GCANN-Gen-NN GGNN-Plasmid-NNTGCANN-Gen-NN
die GG/CC-Paarung bildet dann den Ringschluss.
Man hat jetzt die urschprünglichen Plasmide mit dem neuen Gen kombiniert. Mann nennt das ein „rekombinantes Plasmid“ oder „rekombiniertes Plasmid“.
Diese rekombinanten Plasmide mischt man dann wieder mit Bakterien und bringt sie (irgendwie) dazu, diese Plasmide aufzunehmen.
Natürlich nehmen nicht alle Bakterien das Plasmid auf. Eigentlich tun sie das eher nicht. Einige wenige aber schon. Die muss man finden. Aber statt die Nadel im Heuhaufen zu suchen, bringt man einfach alle um, die _kein_ Plasmid aufgenommen haben. Wie? Ganz einfach: auf dem Plasmid ist ein Resistenzgen. Bekterien, die ein solches Gen besitzten, sind dann Resistent gegen ein bestimmtes Antibiotikum. Kippt man also jetzt dieses Antibiotikum ins Medium, dann überleben nur die Bakterien, die eins der Plasmide aufgenommen haben und damit auch im Besitz des Resistenzgens sind.
Das war’s eigentlich. Natürlich kann noch mehr schiefgehen, und um das zu kontrollieren gibt es noch mehr Verfahren („Blau-Weiß-Selektion“, Negativ-Selektion" usw), aber das sprecngt den Rahmen.
Ich hoffe, das hat etwas geholfen,
LG
Jochen
