Hey ihr lieben, ich hab mal eine Frage: Wir machen gerade eine Real time PCR mit SYBR Green, und es klappt alles super…das einzige Problem was wir haben, wir bekommen im Blank (also negativkontrolle…mastermix usw ohne dna) bei höherer Zyklenzahl immer ein Produkt. Laut Schmelzkurve sind es auch keine Primerdimere… und es tritt nur beim GAPDH auf und nicht bei unserer Probe… Kann mir das jemand erklären, woher da das Produkt kommt?
DAAAANKEEE
Endprodukt auf Agarosegel auftragen
Hallo!
Wenn die Negativkontrolle etwas (!) nach oben geht, dann sollte das nicht so tragisch sein. Vielleicht doch primer dimer, die Du in der Schmelzkurve nicht so gut siehst. Um sicher zu gehen schlage ich vor, dass Du das Endprodukt Deiner Negativkontrolle auf ein Agarosegel auftraegst*. Dann kannst Du sehen, ob Du wirklich ein Produkt hast. Falls Du im Gel was siehst, dann kannst Du die Bande ausschneiden und sequenzieren.
* Evtl ist es besser mehrere Negativkontrollen mit einem PCR Purification Kit zu konzentrieren, da die Menge an Produkt per Reaktion (wenn denn welches vorhanden ist) unter der Nachweisgrenze liegen kann. Zudem schlage ich vor ein hochprozentiges Agarosegel zu verwenden (wenigstens 2%), damit Du auch kleine Fragmente sehen kannst.
Viel Erfolg,
Marcus