Karminessigsäure statt Methylenblau?

Wissenschaft Biologie
#1

Hallöchen!

  • Eventuell wäre meine Frage im Chemiebaum besser aufgehoben, allerdings finde ich hier vielleicht eher Erfahrungsschätze. Bei Bedarf bitte ich um Verschiebung -

Ich habe vor, mit Schülern zusammen die eigene DNA zu extrahieren und sichtbar zu machen.

Nun habe ich zufällig eine Anleitung gefunden, wie man diese extrahierte DNA später auch einfärben kann (keine Ahnung, weshalb ich da nicht vorher drauf gekommen bin).

Färbemittel ist hierbei Methylenblau. Das kann ich aber nicht mehr organisieren (es sei denn, die Schule hat sowas da, ich bin nur für die Versuche ein paar Stunden da und weiß deshalb nicht, wie die ausgestattet sind).
Ich hätte allerdings noch Karminessigsäure hier, womit wir die Mitosestadien in der Wurzelspitze gefärbt haben. Außerdem hab ich noch Kernechtrot in Pulverform hier.

Daher meine Frage: Eignet sich eins davon als Ersatz für das Methylenblau?

Danke fürs Lesen und besonders Danke fürs Antworten schon mal!:smile:

#2

Hallo LadyLockenlicht,

ich weiß ja nicht an welchen Extraktionsmaßstab du gedacht hast. Meine eigene DNA hab ich noch nie extrahiert. Aber die Menge, die man aus einem Esslöffel geriebene Zucchini (oder anderen Pflanzen) herausbekommt ist nach Fällung im Alkohol als glasig-weißlicher Klumpen schön sichtbar. Die muß man nicht mehr zusätzlich anfärben.

Im Labor färben wir mit Ethidiumbromid, aber nur in Gelen. Aber EtBr ist für ein Schülerexperiment natürlich nicht geeignet.

Viele Grüße
Eva

#3

Huhu!

Ja, das hab ich auch gelesen:smile:

Ich weiß auch, dass man die recht gut so sehen kann, zumindest als milchiges Wölkchen…Wär halt einfach noch ein schöner, farbiger Aha-Effekt zusätzlich (außerdem tendiere ich dazu, zu viel Zeit einzuplanen). Es sah auf dem Bild der Versuchsbeschreibung einfach toll aus.

Wäre Gemüse-DNA denn irgendwie besser zum Färben geeignet als menschliche? (Vorrausgesetzt, das ginge mit Karminessig)

Beste Grüße

#4

außerdem tendiere ich dazu, zu
viel Zeit einzuplanen).

Zeitmäßig würde ich für eine Extraktion aus „zermanschten“ Pflanzen ca. 60-90 Minuten einplanen bis zur Fällung.

Wäre Gemüse-DNA denn irgendwie besser zum Färben geeignet als
menschliche? (Vorrausgesetzt, das ginge mit Karminessig)

Der DNA ist es egal, ob sie aus Pflanzen oder Menschen kommt.

Leider kann ich dir nichts zu deiner Frage mit Karminessigsäure sagen. Damit hab ich seit über 20 Jahren nichts gemacht. Bin mir aber nicht sicher, inwieweit der pH-Wert eine Rolle bei der Färbereaktion mit KE spielt. Du dürftest dann halt wohl nicht zu sehr verdünnen.

Muß es denn immer was spektakuläres sein? Kann man die Schüler nicht auch so für Biologie begeistern, ohne daß irgendwas stinkt, raucht, zuckt oder in Farben leuchtet? :wink:

Wenn wir bei uns an der Uni Schülertage (ca. 14-17jährige) haben machen wir das Zucchiniprotokoll. Bis jetzt waren noch immer alle auch ohne Färbung begeistert vom Ergebnis. Vorteil ist halt, daß man bei Pflanzen beliebig viel Material einsetzen kann und entsprechend hohe Ausbeuten hat, die man auch mit bloßem Auge gut sehen kann. Bei DNA-Isolierung aus Blut mußt wohl schon etwas mehr abzapfen als nur ein Tröpfchen um das gut sichtbar zu machen.

Viele Grüße
Eva

#5

Hallo!

Zeitmäßig würde ich für eine Extraktion aus „zermanschten“
Pflanzen ca. 60-90 Minuten einplanen bis zur Fällung.

Nein, dafür reichen 45min gemütlich. Die Inkubationsschritte kann man nutzen, um das bisschen Theorie dazu zu erklären (Wieso Spülmittel? etc.) oder um zu spülen.

Ich mach’s auch ohne zu färben, aus Tomate, Banane oder Kiwi (Diese Früchte haben ein schön weiches Gewebe, dass sich leicht aufschließen lässt).

Michael

#6

Hallo!

Zeitmäßig würde ich für eine Extraktion aus „zermanschten“
Pflanzen ca. 60-90 Minuten einplanen bis zur Fällung.

Nein, dafür reichen 45min gemütlich. Die Inkubationsschritte
kann man nutzen, um das bisschen Theorie dazu zu erklären
(Wieso Spülmittel? etc.) oder um zu spülen.

Eva hat dabei sicher nur die reinen praktischen Handgriffe gemeint und weniger die Didaktik davor/dabei/danach.
Ich glaube auch, dass das in einer Schulstunde machbar ist und habe mir auch genau diese theoretische Aufbereitung der einzelnen Schritte für die Inkubationszeiten vorgenommen.

Man kanns halt so oder so machen. Im Labor im Studium haben wir auch länger gebraucht, in meinen Testläufen für die Unterrichtsstunde ging es schneller. Kommt wohl immer auf den genauen Versuchsaufbau an.

Du sagst, du nutzt auch eher Obst oder Gemüse - weshalb ziehst du das vor? Sauen die Schüler zu sehr rum mit Speichel oder ekeln und zieren sie sich bei der Durchführung? Oder gibt das Obst einfach mehr her, weil leichter zu extrahieren?

#7

Hallo!

Du sagst, du nutzt auch eher Obst oder Gemüse - weshalb ziehst
du das vor? Sauen die Schüler zu sehr rum mit Speichel oder
ekeln und zieren sie sich bei der Durchführung? Oder gibt das
Obst einfach mehr her, weil leichter zu extrahieren?

Never change a winning Team. Soll heißen: Ich habe es mit dieser Vorschrift gelernt, es klappt, ich habe nie etwas anderes ausprobiert.

Geht so:

Ethanol auf Eis stellen.
eine viertel Tomate kleineschneiden.
30 ml Extraktionspuffer zugeben
5min Zimmertemperatur
Mörsern (ca. 5 min)
Filtrieren (Als Filter unbedingt Kaffeefilter verwenden, keine Laborfilter!)
Filtrat vorsichtig auf eiskalten Ethanol tropfen (Mischungsverhältnis etwa 1:1)
DNA fällt aus und kann mit einem Holzstab oder einer Impföse rausgefischt werden.

Rezept für den Extraktionspuffer:

  • 44 g Natriumcitrat-dihydrat
  • 8,8 g Kochsalz
  • 100 mL Spülmittel
  • mit Wasser auf einen Liter auffüllen.

Michael

#8

Huhu!

Danke, so ähnlich habe ich das auch (hab erst auch Gemüse erwägt aber fand persönlich Mundschleimhaut dann besser).

Aber bei dir gibt es gar keinen Schritt zum erwärmen um die DNasen zu denaturieren? Macht das alles dein Puffer?

Meine Lösung besteht nur aus Spülmittel, Salz und Wasser. Und dann ab ins Wasserbad für 15 Minuten.

Weil wir hier grad so schön plaudern, ich hatte die Frage schon im Haushaltsbrett gestellt:
Würde ein Hot Dog Maker, der sonst Würsten durch Wasserdampf gart wohl auch gehen? Anstelle des Wasserbades? Der kann ja eigentlich nicht so heiß werden, dass die DNA auch denaturiert denk ich mir, Würstchen platzen ja auch bei zu großer Hitze:smiley:
Wollte das erwärmen erst mit meiner Joghurtmaschine machen, aber die kommt über 30 °C nicht hinaus und ich bräuchte eher 60°C.

Bzw. brauch ich? Du brauchst die ja scheinbar nicht. Wo ist der Unterschied?

#9

Hallo Michael,

klar gehts auch in 45 Minuten. Ich plane halt lieber mehr Zeit ein, je nach Gruppengröße. Man kann ja auch noch vieles erzählen zwischendrin.

Gruß
Eva

Unser Quick-and-dirty-Protokoll für Demozwecke sieht so aus:

DNA-Extraktion aus Zucchini

Man benötigt:
Feine Küchenreibe
Plastikschale
Esslöffel
Messzylinder
Messlöffel
Becherglas (2x 250 ml, 1x 100 ml)
Wasserbad
Glas mit Schraubverschluss
Eisschale + Eis
Sieb
Falcon-Röhrchen

Zucchini
Salz
H2O
Waschpulver (flüssig, evtl. Wollwaschmittel; bewährt hat sich ALDI Color)
Isopropanol (eisgekühlt), alternativ auch Ethanol, dann muß aber bei Punkt 7 das 2,5-fache Volumen verwendet werden

Durchführung:

  1. Die Zucchini mit der Reibe fein reiben bis man ca. 1 Esslöffel geriebenes Material erhält.

  2. Aus 200 ml H2O, 20 ml Waschpulver und ca. 2 leicht gehäuften Messlöffeln Salz (ca. 2 Teelöffel) einen Puffer anrühren.

  3. 1 EL geriebene Zucchini zusammen mit 25 ml von dem Puffer in ein Glas mit Schraubverschluss geben und für 15 min. unter leichtem Schwenken in ein 60°C heißes Wasserbad stellen.

  4. Das Glas nach dem Wasserbad für ca. 5 min. auf Eis abkühlen.

  5. Den Inhalt des Glases durch ein Sieb in ein Becherglas sieben. Evtl. kann man hier noch etwas Mull einlegen um mehr Zellbestandteile im Sieb zurück zu halten.

  6. Von der abgesiebten Flüssigkeit werden 15 ml in ein Falcon-Röhrchen gegeben.

  7. Im Anschluss 15 ml eiskaltes Isopropanol langsam vom Rand in das leicht schräg gehaltene Falcon-Röhrchen laufen lassen.

Da Alkohol leichter ist als Wasser setzt er sich zunächst oben ab und es entstehen zwei Phasen in dem Falcon-Röhrchen. Die obere Phase ist die Isopropanolphase und die untere die Wasserphase. Durch sanftes Schwenken die Phasen mischen und die DNA ausfällen. Der Vorgang der Ausfällung kann sehr schön beobachtet werden.

Das DNA-Knäuel kann man nun mit einem Glasstab, Pasteurpipette, Schaschlikstab oder ähnlichem herausfischen. Ggf. in ein Eppendorf-Gefäß mit 1 ml. 70% Alkohol geben zum Aufheben.

#10

Hallo!

Aber bei dir gibt es gar keinen Schritt zum erwärmen um die
DNasen zu denaturieren? Macht das alles dein Puffer?

Das kann ich Dir nicht sagen. Die Methode ist wirklich sehr „robust“. Soll heißen: Ich konnte beim letzten Mal kein Na-Citrat in der Sammlung finden. Ich weiß nicht mehr, ob ich es durch Zitronensäure ersetzt oder ersatzlos weggelassen habe. Es hat trotzdem funktioniert.

Warum es den Denaturierungsschritt in meinem Protokoll nicht gibt … keine Ahnung. Vielleicht weil Pflanzen so viel DNA enthalten oder so wenig DNAsen oder … was weiß icht? Ich habe das Protokoll auch nur geklaut. Meine Quelle: Ein Arbeitsblatt, das von Gerhard Braun aus Schwäbisch Gmünd entworfen wurde. Ich weiß nicht mal mehr, woher ich das Blatt habe, und den Herrn Braun kenne ich - glaube ich - höchstens von einer ganz anderen Fortbildung…

Aber, jetzt wo Du fragst, schau mal, was ich auf diesem Arbeitsblatt gefunden habe. Hilft Dir das weiter?

„Nach dem Isolieren des Klumpens kann die DNA mit Fuchsinschwefliger Säure oder mit Toluidinblau angefärbt werden. Der Nachweis ist positiv, wenn sich der Klumpen nach Zugabe von Wasser nicht mehr entfärben lässt.“

Ob das mit dem HotDog-Maker geht, weiß ich nicht. DNA schmilzt bei 95°C, von daher: kritisch. Außerdem habe ich immer so meine Vorbehalte gegen Küchengeräte als Laborgeräte. Aber das kannst Du natürlich halten, wie Du willst.

Michael