Hallo!
Ich will ein mit Hind III und Xba I geschnittenes und aufgereinigtes PCR Produkt an einen mit den gleichen Enzymen verdauten und aufgereinigten Vektor ligieren um das PCR Amplikon zu klonieren.
Jemand hat mir gesagt, ich solle das geschnittene Plasmid SAPen, um Autoreligation zu verhindern. Ich finde das sehr komisch, schließlich habe ich mit unterschiedlichen Enzymen verdaut und aufgereinigt.
Außerdem haben wir keine SAP sondern nur CIP und die will ich nicht so gern benutzen, weil die ja so hitzestabil ist.
Habt ihr Erfahrungen, ob in solchen Fällen SAPen oder CIPen wirklich nötig ist?
Gruß, Stefan
Hallo Stefan,
Das Dephosphorylieren des verdauten Vektors ist normalerweise sehr sinnvoll. Wenn es ein neuer Vektor war, dann wird das durch deine Enzyme aus der MCS herausgeschnittene DNA-Stück sehr klein sein. Es ist in der Regel so klein, dass du es auf einem Gel nicht erkennen kannst.
Stell dir jetzt vor, dein Verdau war nicht 100% vollständig (und das kann man oft nicht überprüfen). Dann wäre aufgrund der kompatiblen sticky ends eine intramolekulare Re-Ligation des Vektors nicht nur möglich, sondern auch im Vergleich zur intermolekularen Ligation nach Insertion das Hauptprodukt.
Die Konsequenz wäre, dass vieleicht nur eine von 1000 Transformaten das korrekte Plasmid trägt und der Rest „false positives“ sind.
Beim Insert ist die Re-Ligation übrigens kein ernstes Problem, da es in der Regel die Resistenzkassette nicht trägt. Meistens nimmt man einfach einen Überschuss an Insert bei der Ligationsreaktion.
Technisches:
Ich nehme meine verdauten Plasmide und starte die CIP- oder SAP-Reaktion nach Herstellerprotokoll. Die Abtrennung und präparative Reinigung führe ich dann so durch, dass das gesamte Reaktionsgemisch auf ein SDS-PAGE gepackt wird. Nachher schneide ich die DNA-Bande aus und reigige entsprechend nochmals. Hitzedeaktivierung wäre auch möglich, dann bleibt allerdings der Proteinschrott mit drin.
Gruß,
Van Dusen