Meine Frage ist, ob man Southern Blotting überhaupt noch macht, seit man die quantitative Realtime PCR hat?
Bitte mit einer Begründung.
Danke schonmal!
Hallo Joyner,
Mir ist es in gute einem Dutzend Labors jedenfalls noch nicht über den Weg gelaufen.
Grüße!
Hallo Joyner,
ich wüßte nicht, wofür man heute noch einen Southern Blot einsetzen sollte, habe aber auch vor 2000 nie damit gearbeitet. Meines Wissens nach wurde der Southern Blot so zwischen 2005 und 2008 langsam durch RT-PCR ersetzt und nur zeitweilig parallel durchgeführt um die PCR Ergebnisse zu validieren.
Soutthern Blot hatte hatte immerhin den Nachteil, dass es Zeitintensiver war, größtenteils radioaktiv markierte Sonden einetzte und vergleichsweise große Mengen qualitativ hochwertiger DNA benötigte.
BR, Mio.
danke.
und als „ersatz“ wird meistens die qRealt. PCR genommen, oder?
Leider ist es schon viele Jahre her, dass ich mit Southern Blotting zu tun hatte. Inzwischen arbeite ich nicht mehr im Labor. Deswegen kann ich dir die Frage leider nicht beantworten. Entschuldigung.
Ja, macht man schon, denn Realtime PCR ist teuer (nicht alle Arbeitsgruppen haben so viel Geld) und außerdem nicht ganz trivial in der Durchführung.
Grüße Christine
Genau! An sich reicht aber auch eine regulaere PCR, wenn man einfach nur wissen moechte, ob die betreffende Sequenz vorhanden ist.
So untersucht man beispielsweise Patientenproben auf Infektion mit EHEC-Erregern.
danke.
und als „ersatz“ wird meistens die qRealt. PCR genommen, oder?
Hallo, wir machen das nur noch um bei neuen Primer die Annealingtemperatur zu testen. Sonst machen wir nur Realtime. Soutern Blotting ist veraltet und dauert auch länger
Hallo,
ehrlich gesagt weiß ich nicht, ob Southern Blotting heute noch in größerem Umfang gemacht wird. Mein letzter liegt viele Jahre zurück.
Beste Grüße
Marcus Wirth
Ich kann nur fuer mich sprechen. Ich uebe Southern Blot noch aus. Damit habe ich meine Zellen ueberprueft im Zyklus vom Design meiner knock out Maus.
Southern-Blotting hat den entscheidenden Vorteil, dass man häufig das spezifische Gen und das Housekeeping-Gen gemeinsam in einem Ansatz amplifizieren kann, was prinzipiell ein Vorteil gegenüber der Realtime ist. Allerdings -wie bei anderen Blotting-Verfahren auch- kann bei einem sehr starken Signal die Quantifizierung fehlerhaft ausfallen, weil man dann in den Sättigungsbereich der Bandenintensitäten gelangt. Außerdem wird bei der Blott-Variante nur der Gesamtgehalt des Gen-Amplifikats ermittelt, während bei der Realtime bereits während der Amplifikationsphase detektiert wird. Je mehr Template also ursprünglich expremiert wurde, desto rasche sollte in der Probe auch mit einem Signal zu rechnen sein-auf diese Weise wird eine Sättigung des Meßsystems verhindert. Beide Methoden haben demnach Vor- und Nachteile. Letztlich wird die Realtime präferiert und ist zur Zeit State of the Art. Die GelPCR kommt aber noch beim Test neuer Primer zur Ermittlung einer optimalen Annealing-Temperatur zum Einsatz.
Gruß Michael
puh, ich glaube nicht.
SB hätte nur noch ein Darseinsberechtigung: Es ist günstig im Nachweis von DNA, weil man keinen teueren Cycler braucht, dafür im Längen ungenauer/unreproduzierbarer.
Ivo
Servus,
da SB und qRT-PCR unterschiedliche Fragestellungen beantworten, ja.
Gruß,
Sax
Hallo Joyner, kann das natürlich nur für uns beantworten: nein, seit mehr als 10 Jahren machen wir keinen Southern mehr, arbeiten aber eben mit TaqMan Sonden - das ist ebenfalls eine Bestätigung des Fragments