Hallo,
ist die Menge des Auftragspuffers, ich verwende Bromphenolblau, in einer /meiner Multiplex-PCR, relevant für den LAuf im Gel ?
Klar das man nicht Unmengen nehmen kann, aber ich frage deshalb nach, das man auch mal variieren kann, weil unsere Methode grad nicht ganz gut klappt.
LG Annette
Hallo Annette,
In aller Kürze: meines Wissens nein.
Mir ist zumindest nie aufgefallen, dass eine größere Menge Auftragspuffer bei der Elektrophorese gestört hätte.
Spätestens, wenn man die Probe in die Tasche gibt, wird der Auftragspuffer ja eh wieder verdünnt. Was du im Umkehrschluss vielleicht vermeiden solltest: zu viel Auftragspuffer je Tasche. Ich sehe kein Problem dabei, beispielsweise 1ul DNA in 5ul Auftragspuffer aufzunehmen. Vielleicht würde es aber stören, wenn du eine Tasche vollständig mit Ladepuffer füllst. Selbst da bin ich mir aber auch nicht sicher.
Auf keinen Fall zu wenig Puffer nehmen! Dann landet deine DNA am Ende vielleicht nicht einmal in der Tasche.
Grüße,
Theo.
Bisher hatte ich es so gemacht, oder so wie ich es in der Fortbildung gezeigt bekommen habe:
3ul Wasser, 2ul BPB, 3ul Probe und ab ins Gel
Was ist wenn ich das so belasse, und mehr Probe nehme, weil wir bisher nichts sehen im Gel, also z.B. 20ul Probe
Müsste ich dann die Menge Auftragspuffer erhöhen?
Jetzt in einem anderen Labor, wo ich das gesehen habe, die geben zu dem PCR-Produkt direkt ins Eppi 2,5ul Auftragspuffer, mischen das und geben dann 15-20ul ins Gel.
Vielen Dank für die Hilfe
Re Hallo Annette,
Dein Puffer scheint 4x konzentriert zu sein. Das Wasser ist bedeutungslos und nur zur Verdünnung gedacht. Du musst also nur darauf achten, dass du immer ein Drittel deines Problemvolumens an Auftrags Puffer verwendest. Dann kannst du auch größere Volumen verwenden.
Grüße!
Theo
Bisher hatte ich es so gemacht, oder so wie ich es in d er
Fortbildung gezeigt bekommen habe:3ul Wasser, 2ul BPB, 3ul Probe und ab ins Gel
Was ist wenn ich das so belasse, und mehr Probe nehme, weil
wir bisher nichts sehen im Gel, also z.B. 20ul Probe
Müsste ich dann die Menge Auftragspuffer erhöhen?Jetzt in einem anderen Labor, wo ich das gesehen habe, die
geben zu dem PCR-Produkt direkt ins Eppi 2,5ul Auftragspuffer,
mischen das und geben dann 15-20ul ins Gel.Vielen Dank für die Hilfe
Woher weißt das dieser 4fach konzentriert ist ?
Sprich wenn ich nicht mit Wasser verdünne, sondern gleich höhere Probenvolumina einsetze, könnte ich auch 20ul Probe und 7ul Puffer nehmen ?
Genau.
Ursprünglich hattest du 2ul Puffer in 8ul EndVolumen. Daher müsste der Puffer 4x konzentriert gewesen sein.
Die Mentge sollte keine Rolle spielen. Normalerweise verwende ich einen 6* Puffer und verduenne diesen 1/6 mit meiner Probe. Wenn das PCR Produkt auf der selben Hoehe laeuft wie deine Bromphenolblaue Bande solltest du eventuell den Puffer wechseln. Ich denke nicht das das Resultat auf dem Gel von dem Auftragspuffer so sehr beeinflusst wird.
Es ist so, das ich nach den kennengelernten Angaben 3ul Wasser, 2ul BPB und 3 ul Probe nehmen sollte. Nun will ich es aber mal mit mehr Probe versuchen und überlege, was der beste Ansatz ist mitviel ul BPB …
Hallo,
in meiner Erinnerung war der dann jeweils 5x oder 10x.
d.h. auf eine PCR von 20ul hätte man bei 5x 5ul zugegeben.
ob das jetzt 4 oder 6 sind, ob da noch was an der Spitze klebt ist Jacke wie Hose.
Bei grösseren Abweichungen würde ich schon zur Vorsicht raten:
Zuwenig und die Probe schwimmt dir davon.
Zuviel und klar, da ist doch auch Salz drin (oder?), das könnte schon den Lauf beeinflussen, allerdings kann man auch mit niedriger Spannung anfangen und dann hochfahren, wenn die Probe ins Gel eingezogen ist.
Allerdings kriegst du dann auch riesige blaue Blobs, die dir im dümmsten Fall deine Bande zudecken, so dass du sie nicht mehr recht siehst.
Gruss
Hallo,
was meinst du genau mit 5x oder 10x ?
mein gesamtvolumen in der pcr ist pro reaktion 25ul. daraus habe ich das bisher so ins gel gegeben:
„3ul Wasser, 2ul BPB, 3ul Probe“
Hab es jetzt aber auch anders gesehen, direkt ins PCR-Eppi 2,5ul Orange-G-Puffer und dann 20ul ins GEl.
und ichlass das Gel immer bei 100V ne std.laufen ,
Hier ist mal mein Puffer (6*), vielleicht probierst du das mal (0,25 % Bromphenolblau, 0,1 M EDTA, 30 % Glycerin) Aber das PCR product sollte schon sichtbar sein, auch bei 3ul.
Es ist so, das ich nach den kennengelernten Angaben 3ul
Wasser, 2ul BPB und 3 ul Probe nehmen sollte. Nun will ich es
aber mal mit mehr Probe versuchen und überlege, was der beste
Ansatz ist mitviel ul BPB …
5x war zu meiner Zeit 5-fach konzentriert. 10x zehnfach.
dein Orange Puffer ist offensichtlich 10fach.
Was ist in deinem Bromphenolpuffer drin? warum noch Wasser?? aus der Rechnung entommen wäre der ca. 4x.
Warum laufen deine Gels schlecht?
vielleicht solltest du sie langsamer laufen lassen, wenn sie z. B schmieren oder schlecht auflösen.
Gruss
Hallo Annette,
kannst Du etwas näher erläutern, was Du machen möchtest, bzw. wo das Problem liegt? Wenn ich das richtig verstehe geht es dir lediglich um das post-PCR-Gel, richtig? Dann hat das Bromphenolblau nur bei der entsprechenden Größe einen Effekt auf die EtBr Fluoreszenz.
Grüße, Sebastian
Hallo Annette,
meiner Erfahrung nach ist nur entscheidend, dass das Gel wirklich sehr ordentlich mit Puffer bedeckt ist - ansonsten sollte die PUffermenge m. E. egal sein.
Viele Grüße & gutes Gelingen!
litterae
Hallo,
hatte die Anfrage irgendwie garnicht gesehen. Soweit ich weiss, ist beim Auftragepuffer das Wichtigste, das 10% des Gesamtvolumens das aufgetragen wird Glyzerin ist, damit das Zeug nicht aus der Tasche diffundiert. Sonst sind mir keine Beschränkungen bekannt.
Gruß
Marcus Wirth