Molekularbiologie - Restriktionsenzyme

Wissenschaft Biologie
#1

Die Frage lautet:
Das Restriktionsenzym EcoRI schneidet das Plasmid pUC19 (2686 bp) an Pos. 396, das Enzym BgII an Pos 1813. Nachdem 2mikrogramm pUC 19-Plasmide für kurze Zeit mit den beiden Enzymen zusammen verdaut wurden, erfolgte eine Auftrennung des Restriktionsansatzes durch Gelelektrophorese.
Durch Vergleich mit einem DNA-Standard (100 bp DNA Ladder) wurde die ungefähre Position der durch das Gel aufgetrennten Banden wie folgt ermittelt:
Jeweils eine bande befindet sich bei: 1) ca. 3200 bp 2)ca. 2700 bp 3) ca. 2100 bp 4) ca. 1400 5) ca. 1200 bp

a) Geben sie an, um was es sich bei den jeweiligen Banden handelt und erläutern Sie, warum sich die jeweiligen Banden an der jeweiligen Position befinden.

b)Geben Sie jeweils die tatsächliche Länge der sich in den 5 Banden befindlichen DNA-Molekülen exakt an.

#2

Hallo Miriam1986,
da pUC19 eine Länge von 2686bp hat, wäre die Bande bei 2700 das leere Plasmid einmal durch eines der Restriktionsenzyme geschnitten. Wird das leere Plasmid durch beide Restriktionsenzyme geschnitten, würden zwei Fragmente mit 1269bp und 1417bp entstehen, diese würden den beiden Banden bei 1400 und 1200 entsprechen.
Eine Bande bei 3200bp könnte durch ungeschnittene Plasmide entstehen, durch die geschlossene Struktur würde das Plasmid langsamer als geschnittene DNA durch das Gel wandern, obwohl die Länge identisch wäre. Je nachdem, in welcher Form das Plasid vorliegt, kann es unterschiedlich schnell durch das Gel wandern, und somit eine Bande erzeugen, die nicht identisch mit der tatsächlichen Länge des linearen Plasmids erscheint. Ein Plasmid, welches nicht komplett geschnitten, sondern nur an einem Strang „gebrochen“ wäre, würde langsamer laufen, als das komplett geschnittene lieneare Plasmid, ich würde eine Bande bei circa 3500bp erwarten, obwohl das Plasmid auch nur 2686bp lang ist. Das nicht komplett geschnittene Molekül wandert mit mehr Behinderungen durch das Gel, und ist deshalb langsamer. Genause würde das „supercoiled“ plasmid schneller als die lineare DNA durch das Gel wandern, da es durch seine sehr aufgewundene Form sehr kompakt ist, obwohl ws ebenfalls 2686bp lang ist. Das Plasmid pUC19 sollte supercoiled eine Bande bei circa 1900bp zeigen.
Ansonsten würde die Aufagbe in dieser Form keinen Sinn machen.

LG, Miah.

#3

Hallo Miriam,

zur Beantwortung brauchst du folgende „Ideen“: Wenn du dein Plasmid mit nur einem Enzym schneidest, erhältst du ein Fragment von 2686bp Länge ~2700bp
Schneidest du es mit beiden, erhältst du zwei Fragmente der Länge 1813bp minus 396 bp = ca. 1400 bp .

Es können sich aber geschnittene Fragmente an den Enden wieder zusammenlagern, daher entstehen auch Längere Fragmente. Die Unterschiedlichen Banden kommen von „verschiedenen Kombinationen“ der zusammengelagerten Einzelfragmente.

Ausrechnen darfst du aber selber :wink:

#4

Hallo Miriam,
ist das eine Aufgabe von einem Praktikum? Es wäre schön gewesen, wenn du etwas mehr zu deinem genauen Problem bei der Aufgabe geschrieben hättest…
Die Aufgabe an sich ist ganz einfach. Plasmid wird mit zwei Restriktionsenzymen geschnitten --> zwei Banden zu erwarten (größeres Fragment und kleineres Fragment). Da die Restriktion aber nicht vollständig war, tauchen noch zusätzlich drei Formen auf (supercoiled, zirkulär und linear).
Für b) musst du nur 1813-393 und das Ergebnis von der Gesamtgröße abziehen.
Das ist alles.
Viele Grüße Lena