ich wollte mich erkundigen ob man das auch als Ersatz für einen Microarray einsetzen kann und ob man damit einen Microarray ersetzen kann und wie man sich das dann vorstellen kann?
Hallo joyner,
rein theoretisch könntest Du natürlich einen Microarray ersetzen. Ich möchte da aber an allererster Stelle die Kostenanfrage ansprechen. Ein Microarray ist bei Weitem günstiger, als eine Genomsequenzierung mittels bsp. 454 (heute Roche?).
Ich bin schon ein paar Jahre aus der Materie raus, aber zu meiner Zeit hatte so ein Ansatz 8000,- € gekostet.
Wie Du Dir so eine Sequenzierung vorstellen musst, ist sicher vom Gerät und der verwendeten Technologie abhängig, weiterhin reicht meine Erfahrung auch nicht so weit. Vielleicht magst Du Deine Fragestellung ja ein wenig mehr erläutern?
Viele Grüße!
Da kann ich dir leider nicht weiterhelfen.
Hallo,
ob Next-Generation-Sequencing Microarrays ersetzen werden und können, läßt sich zur Zeit nicht sicher beantworten, das hängt sicher auch von der spezifischen Fragestellung, die untersucht werden soll, ab.
Meist werden Microarrays heutzutage für quantifizierende Fragestellungen eingesetzt. Hier geht es um die Frage, ob bestimmte Sequenzen detektiert werden können oder wie stark diese in bestimmten Zellen oder Geweben exprimiert werden.
Bei der Sequenzierung ist mehr die Sequenzanalyse im Vordergrund.
Sicher bietet der technische Fortschritt inwischen die Möglichkeit der Quantifizierung in „Next Generation Sequencing“ und auch der Analyse nicht codierender miRNA. Durch die Möglichkeit schnell und umfassend zu analysieren können auch die Anzahl an Kopien einer Sequenz ermittelt werden.
Vorteil der Microarrays sind jedoch noch immer die weitaus geringeren Kosten. Mit einem Microarray können hunderte Proben gleichzeitig untersucht werden. Außerdem ist auch die zu untersuchende Datenmenge bei NGS relevant. Die zu anayliserende Datenmenge bei NGS ist um ein vielfaches höher und erfordert geeignete Hard- und Software, wie Cloud-Services oder Cluster. Die Analysen können nicht mehr auf einem lokalen Rechner ausgeführt werden.
Sicher wird NGS mit weiterer Entwicklung und Verbreitung günstiger werden. Und auch die stetig wachsende Menge an Informationen über RNA Moleküle werden die Aktualität von Mikroarrays beeinträchtigen, so das ihr Einsatz in der Forschung sicher längerfristik durch NGS verdrängt wird. In der Diagnostic werden Microarrays jedoch wahscheinlich etabliert bleiben, und sich in den kommenden Jahren weiter spezialisieren.
Ich hoffe das hilft Dir etwas.
Hallo joyner,
definitiv ja. NGS Technologien gibt es viele, 5 sind meines Wissens gebräuchlich (Roche/454, lifetech SOLID, lifetech ION TORRENT, Illumina (zB GS FLX) und Pacific Bio). Die Methoden sind grundverschieden und es würde den Rahmen der Antwort sprengen.
Microarrays haben auch heute noch (in Zeiten von Nanoliter-Quantitativen PCRs (zB Fluidigm Biomark) eine gewisse Bedeutung, weil man relativ kostengünstig vergleichende Genexpressions-Experimente machen kann und einen UNGENAUEN (im Vergleich zu QPCR oder Digitaler Genexpression), aber brauchbaren Überblick schnell gewinnen kann, wo es sich lohnt, weiterzumachen. Ausserdem ist es auch möglich, Proteine/Peptide auf Microarrays zu bringen, mit einem weiten Anwendungsfeld.
Leute wie Rothberg, Hunkapiller und viele andere haben aber in den letzten Jahren immens viel weitergebracht, Nachteil am NGS sind allerdings noch immer tw die Kosten (obwohl die rasend schnell bis jetzt gesunken sind) und ein hoher bioinformatischer Aufwand (absolut gesehen), mit dem hohen Aufwend generiert man sehr viel Information.
Quintessenz: technisch ersetzen: ja, oder mehr noch als ersetzen. Kostengünstig/wirtschaftlich ersetzen: derzeit nein, da haben Microarrays noch eine Daseinsberechtigung.
ich wollte mich erkundigen ob man das auch als Ersatz für
einen Microarray einsetzen kann und ob man damit einen
Microarray ersetzen kann und wie man sich das dann vorstellen
kann?
Hallo Joyner,
tut mir leid, dazu kann ich nichtssagen.
ich frage deswegen, weil mir nicht ganz klar war, was ich in einem Gespräch mit einem hörte:
Er sagte es könnte zukunftig meine Aufgabe sein, mittels RNAi bei Arabidopsis Gene zu silencen und danach zu schauen, was der Genverlust auf die Virusresistenz des Pflanze hat. Dazu soll viel qPCR gemacht werden und Transkriptomstudien dieser Gene mit NGS bearbeitet werden, da Microarrays zu teuer seien.
Kannst du mir erklären was genau gemeint ist, denn ich hab seinen Denkansatz nicht richtig verstanden, wollte mir aber nix anmerken lassen und hab nicht wirklich nachgefragt. Bspw ist mir nicht ganz klar wieso Gene stillgelegt werden sollen aber danach soll davon die Genaktivität mittels NGS gemessen werden. hm? ^^
ich frage deswegen, weil mir nicht ganz klar war, was ich in einem Prof Gespräch mit einem hörte:
Er sagte es könnte zukunftig meine Aufgabe sein, mittels RNAi bei Arabidopsis Gene zu silencen und danach zu schauen, welche Auswirkung der Genverlust auf die Virusresistenz des Pflanze hat. Dazu soll viel qPCR gemacht werden und Transkriptomstudien dieser Gene mit NGS bearbeitet werden, da Microarrays zu teuer seien und die DFG oder Uni (?) diese nicht erlaubt.
Kannst du mir erklären was genau gemeint ist, denn ich hab seinen Denkansatz nicht richtig verstanden, wollte mir aber nix anmerken lassen und hab nicht wirklich nachgefragt. Bspw ist mir nicht ganz klar wieso Gene stillgelegt werden sollen aber danach soll davon die Genaktivität mittels NGS gemessen werden. hm? ^^
Ich hoffe doch, dass die Wissenschaft ein wenig Freiheit hat, und damit auch methodisch… nein, ganz klar ist es mir nicht, aber ich versuch´s einmal:
silencen ist klar, damit können aber auch miRNAs gemeint sein, und das kann dann immens viele Auswirkungen auf sehr viele Gene haben (auch eben kleinere Auswirkungen, die man auf Microarrays nicht mehr unterscheiden kann.) Bzw allein durch ein KO Gen können in einer Kaskade nachfolgende Gene reguliert werden, macht also schon Sinn.
Wenn man mit bestimmten Theorien arbeitet bzw mit einem gut untersuchten Organismus wie Arabidopsis, dann weiss man eventuell, wonach man sucht und muss nicht mehr mit Microarrays screenen, sondern kann gleich 100-10.000 Transkripte mit qPCR quantifizieren.
Ausserdem ist Arabidopsis deutlich kleiner als das Humangenom, man kann verschiedene Barcode Adaptoren ligieren und damit auch auf eine NGS lane mehrere Proben mit einer guten coverage sequenzieren.
Und: Wenn ein Prof eine Lieblingstheorie hat (also Präferenz/Überzeugung) oder auch bestimmte Techniken nach aussen hin favorisiert und Drittmittel einwirbt (dh „politische“ Interessen" hat), dann machts keinen Sinn, technische Einwände zu haben, bevor man ihn nicht besser kennt, weiss, dass er Einwände tatsächlich wünscht und man nicht einen Versuchsballon unter 4 Augen gestartet hat.
Sonst: siehe erster Satz, es wär mir nicht bekannt, dass DFG oder irgendeine Uni Microarrays „verbieten“ würde… da bleibt dann nur die Möglichkeit, dass Arabidopsis-Microarrays schon so oft publiziert wurden, dass es nicht mehr als „förderungswürdig“ gilt und man nichts mehr ernsthaft publizieren kann; das ist jetzt aber nur eine Theorie von mir, ich hab da keinen Überblick auf diesem Thema.
Also es sollen ganz bestimmte Gene der Signaltransduktionskaskaden verschiedener Phytohormone gesilenced werden mit „VIGS“. Dann hat er noch was von Klonieren und mit Agrobakterien Blätter infizieren gesagt, wo ich aber nicht ganz den Zusammenhang verstanden habe.
Aber wieso soll man qPCR eine Gens machen, das ausgeschaltet ist? ^^
Vielleicht meint er ja dass man Kandidatengene anschaut und an denen dann die Expression differentiell misst
Das messen der Transkription eines deaktivierten Genes würde in der Tat wenig Sinn machen, höchstens eine Kontrolle könnte durchgeführt werden. Falls in diesem Fall aber bei einem Organismus ein Transkriptomprofil aller transkribierten Gene erstellt werden soll, würde NGS Sinn machen, da hier eine große Menge Gene ausgewertet werden kann. Die Stärke von NGS liegt hier in der Kapazität eine vergleichsweise große Menge an Genen zu analysieren und auch seltene Transkripte erfassen zu können, so können auch geringfügige Veränderungen im Profil leichter entdeckt werden. Real-Time-quantitative-PCR kann die Analyse des Profils abrunden, hier könnten Merkmalsausprägungen oder einzelne Gene gesondert analysiert werden. Bei einem Transkriptomprofil könnte man sehen, welche Wirkung die Deaktivierung eines Genes auf alle anderen hat, mit Hilfe von NGS könnte man auch quantitative Vergleiche durchführen, um zu sehen ob Gene mehr oder weniger transkribiert werden.
NGS bietet durch die Sequenzierung die Möglichkeit neue Klassen von RNA zu identifizieren, Punktmutationen in Transkripten, Transkriptfusionen oder auch alternatives Splicen zu detektieren. Die Sequenzierung der DNA Transkripte kann daher detaillierte und interessante Ergebnisse liefern, jedoch muss hierfür auch eine große Menge an Daten analysiert werden, da Abweichungen selten auftreten können. Interessant ist hierbei aber auf jeden Fall Veränderungen in den Sequenzen der Transkripte aufspühren zu können.
Ich hoffe, ich habe die Frage richtig verstanden, und die Antwort hilft Dir etwas.
Hallo,
ich gehe mal davon aus, dass Sie einen DNA Microarray meinen. NGS kann momentan diese Technologien nicht ersetzen, dies wird aber in wahrscheinlich nicht so extrem ferner Zukunft der Fall sein. Ersetzen kann man evtl. heute schon die SNP-Chips. Mit NGS kann man whole genome analysen betreiben. Es wird also die gesamte DNA sequenziert oder auch nur gewünschte Teilabschnitte. Quantitative Aussagen lassen sich nicht genau machen.
Momentan ist NGS eine gute Ergänzung zu Arrays bzw. umgekehrt. Die Kosten für eine komplett Sequenzierung eines Humanen Genoms beläuft sich momentan auf ca. 6000 Dollar (je nach Technik). Dies wird sich aber dieses Jahr noch auf ca. 1000 Dollar reduzieren.
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Kaskaden heisst, dass mehrere nchfolgende Gene reguliert werden und die sieht man sich mit qPCR an
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Oder es handelt sich bei VIGS um keinen kompletten knockout, sondern um eine Runterregulierung (ich hab mich jetzt nicht eingelesen)
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Pflanzentransformationen funktionieren im Prinzip nach:a) Gen ins Plasmid klonieren b) Ecoli transformieren, c) Agrobakterien transformieren d)Pflanzen damit behandeln.
Ab diesem Punkt schweift das Ganze schon seeehr weit ab - es macht zuerst einmal Sinn, dass Du Dich umfassend in das Thema einliest, dh von allen Begriffen Dir mal selber ein Basiswissen aneignest und die Verknüpfungen selber herstellst (gehört zu einer akademischen Arbeit dazu) - und wenns dann Fragen gibt, gerne wieder. Viel Erfolg! M
Ja, durch neue Sequenziertechnologien lassen sich Microarrays ersetzen. Dies ist aber von der speziellen Anwendung abhängig. einige bestimmte Microarray-Anwendungen sind meines Wissens noch nicht über nextgen Seq. verfügbar (z.B. Methylierungssensitivität) sollte aber in Zukunft auch möglich sein (3. gen Seq.).
Einen ganz normalen Microarray, der die Expression von mRNA ausgibt kann man über RNA-seq ersetzen. siehe (http://www.nature.com/nrg/journal/v10/n1/abs/nrg2484…) dies ist zwar wesentlich teurer, aber diese tecnik gibt ja nicht nur die Expressionshöhe aus, sondern auch die Sequenz. Somit können z.B. Mutationen, Splicevarianten oder RNA-editing nachgewiesen werden.
Beim nextgen-Sequenzieren wird über die Häufigkeit einer gelesenen Sequenz in den verschiedenen Proben ein digitales Expressionsprofil erstellt.