HI !
Würd gern wissen wovon die Größe und
die Menge des PCR Produkts abhängt.
Die Größe eines PCR-Produktes hängt davon ab, welche primer Du generiert hast.
Je weiter diese voneinander entfernt auf dem Template (DNA) liegen, desto größer wird letztlich das ausfallende PCR-Produkt. Wenn Du cDNA amplifizieren möchtest, die ursprünglich aus einer RNA generiert worden ist, kommt noch dazu, dass mögliche Intron, nicht codierende DNA-Abschnitte innerhalb des Gens mit amplifiziert werden könnten (ein Hinweis auf eine genomische Kontamination Deines Templates. Legst Du Deine Primer „über“ ein Intron werden hingegen nur Produkte amplifiziert, die kein Intron enthalten, weil der Primer nur dann spezifisch binden kann, wenn sein Template in korrekter Reihenfolge ohne Unterbrechung vorliegt.
Die Menge Deines PCR-Produktes ist abhängig davon, wie viele Cyklen Du auf Deinem Cycler durchlaufen läßt. Die Amplifikate werden dabei exponentiell vermehrt. Typischerweise macht man 30-40 Zyklen, weil bei einer erhöhten Zyklenzahl die Polymerase irgendwann nur noch fehlerhaft arbeitet. Bei zu wenigen Zyklen kann es hingegen sein, dass Du Dein Produkt nicht sehen kannst, weil die amplifizierte Menge den notwendigen detektiebaren minmalen Schwellenwert noch nicht überschritten hat.
Alles klar?
Gruß
Fuhrmi
HI !
Würd gern wissen wovon die Größe und
die Menge des PCR Produkts abhängt.
danke dir,
hab verstanden!
Hi!
Die Groesse haengt u.a. ab von:
- den gewaehlten Primern bzw. deren Bindugsstellen
- der Elongationszeit
- der DNA Polymerase
Die Menge:
- Anzahl der Zyklen
- Menge des Ausgangsmaterials
- Menge der dNTPs, Primer
Marcus
Die Größe Hängt von der Wahl der Oligonukleotide (Primer) ab. Da eine PCR eine sequenzspezifische amplifikation ist, wird durch die Oligonukleotide der Bereich flankiert, der amplifiziert werden soll. Ein Beispiel: Man möchte die komplette kodierende Sequenz einer bestimmten messenger RNA (für die Reaktion zuvor revers transkribiert in cDNA) amplifiziernen, so wählt man Oligonukleotide, die das Startkodon und das Stopkodon der Sequenz mit einschließen. Sagen wir diese Sequenz hätte nun 500 Basen, somit hätte das Produkt eine Größe von 500 bp.
Gesetzt den Fall, dass es unter bestimmten Bedingungen aber eine Spleißvariante dieses Gens gibt, bei dem ein Exon mit 50 bp heraus gespleißt wurde, wäre das Produkt nur 450 bp lang.
Die Menge des Produkts ist abhängig von der Menge an Oligonukleotiden und zudem von den freien Nukleotiden (dNTPs), die in die PCR eingesetzt werden. Das sind die limitierenden Faktoren in der PCR. ist eines von beiden aufgebraucht, so ist die Plateauphase der PCR erreicht und die Reaktion beendet. Je nach Ausgangsmenge der zu amplifizierenden „Template“ DNA wird das Plateau früher bzw. später erreicht. das ist dann das Prinzip der quantitativen PCR.