Proteinkomplex nach Gelfiltration nativ aufkonzent

Wissenschaft Biologie
#1

Hallo,

ich habe ein Membranprotein mit Hilfe von milden Detergentien aus einer Hefemembran isoliert. Nach einer Blue-native-Gelelektrophorese weiß ich, daß mein Protein in einem 440 kDa Komplex vorkommt. Diesen habe ich über eine FPLC mittels Gelchromatographie fraktioniert. Nun habe ich 20 ml einer Proteinlösung mit Detergentien, die ich gern aufkonzentrieren würde. Leider hat die Ultrafiltration mit cut off von 200 kDA nicht funktioniert (kein Komplex mehr im Retentat), weil der Komplex womöglich, aufgrund der hydrophoben Eigenschaften, an der Filtrationsmembran gebunden wurde. Außerdem habe ich die Vermutung, daß die Ultrafiltration die Detergentien zur Bildung der Micellen entzieht, sodaß die Proteine ausfallen könnten.

Wer kann mir weiterhelfen?

#2

Hallo FalkM,

mir fällt spontan Dialyse gegen einen hypertonen Puffer ein.

LG
Huttatta

#3

Hallo Huttatta,

wie stark kann man durch die Dialyse aufkonzentrieren? Ich würde gern die 20 ml komplett auf ein Gel laden (bis ca. 100µl). Ist das möglich? Ich hatte auch schon über Lyophilisierung nachgedacht. Allerdings wird der komplex dabei womöglich zerstört.

#4

Hallo FalkM,

wie stark kann man durch die Dialyse aufkonzentrieren? Ich
würde gern die 20 ml komplett auf ein Gel laden (bis ca.
100µl). Ist das möglich?

das weiß ich leider nicht. Ich arbeite denaturierend und fälle meine Proteine i.d.R. mit Aceton/TCA. Theoretisch kann das Volumen durch Dialyse und mehrfache Pufferwechsel beliebig reduziert werden. Arbeitest du analytisch oder präparativ? Wie willst du färben? Mit Silber würden vielleicht schon wesentlich geringere Mengen ausreichen.

Ich hatte auch schon über
Lyophilisierung nachgedacht. Allerdings wird der komplex dabei
womöglich zerstört.

Vermutlich auch bei der Fällung. Ich würde Dialyse gegen einen identischen Puffer mit zusätzlich PEG o.ä. versuchen. Dadurch sollte die Pufferzusammensetzung der Probe trotz reduzierten Volumens ungefähr gleich und die Komplexe erhalten bleiben. Ich muss aber gestehen, dass ich das so noch nicht gemacht habe. Vielleicht hat ja noch jemand anders eine Idee oder kann das bestätigen.

LG
Huttatta

#5

mir fällt spontan Dialyse gegen einen hypertonen Puffer ein.

Aber die Pufferionen können doch nach beiden Seiten der Membran diffundieren. Das System kommt dann schnell zu einem Geichgewicht. Die Druck- Ultrafiltration mit einer Amicon Membran wäre m.E. schon die richtige Wahl. Es gibt doch Membranen mit verschiedenem Adsorptionsverhalten ? Bei 400 KD erscheint mir eine Ausschlussgrenze von 200 KD riskant. Eher auf 100 KD gehen.
Wenn das mit der Membranbindung stimmt, kannst Du doch wenn alles trocken gelaufen ist, die Membran herausnehmen, mit Wasser spülen und dann in wenig Volumen eines Puffers von dem Du weißt dass er löst und auch als Auftragspuffer für die Elektrophorese geeignet ist (SDS ?), die Membran extrahieren.
Ich habe mich jetzt etwas in die ursprüngliche Frage vergallopiert.
Udo Becker

#6

hast du die amicon membran vorher abgesättigt ?

zum aufkonzentrieren würde sich evt. auch eine dialyse gegen ammoniumcarbonat anbieten, da müsste sich auch das solubilisierungsmittel rausverdünnen und dann ab in die lyophille, dann hast dein protein in reinsubstanz und kannst es in jeder konz. einstellen.

#7

Aber die Pufferionen können doch nach beiden Seiten der
Membran diffundieren. Das System kommt dann schnell zu einem
Geichgewicht.

Nicht jedoch, wenn nur eine Seite (das Dialysat) zusätzlich große Moleküle wie z.B. PEG enthält und die Porengröße klein genug gewählt wird. PEG kann somit nicht durch die Membran in die Probe diffundieren und hält das osmotische Gefälle aufrecht.

#8

Nicht jedoch, wenn nur eine Seite (das Dialysat) zusätzlich
große Moleküle wie z.B. PEG enthält und die Porengröße klein
genug gewählt wird. PEG kann somit nicht durch die Membran in
die Probe diffundieren und hält das osmotische Gefälle
aufrecht.

Kann man mit PEG einen nennenswerten osmotischen Druck überhaupt aufbauen ? Bei einem Molgewicht PEG von 20 000 hätte eine 0.1 molare Lösung schon 2g/ml PEG.
Grüße Udo Becker