RNAse-H-Aktivität knock-out oder nicht bei RT-PCR

Wissenschaft Biologie
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Hallo!

Kann mir einer sagen, was es dabei auf sich hat, ob eine Reverse Transkriptase nun noch eine RNAse-H-Aktivität hat oder nicht?
In einem Labor, in dem cDNAs von Geweben für ganz normale nachfolgende PCRs für qualitative Expressionsanalysen hergestellt werden, habe ich für diesen Zweck eine Superscript II eingesetzt, eine Reverse Transkriptase des Mouse Moloney Leukemia Virus mit ausgeknockter RNAse H.
Der Postdoc, der mich betreut hat, hat gesagt, es störe nicht, wenn bei der cDNA-Synthese mRNA/cDNA Hybride entstünden.
In einem anderen Labor, in dem ich jetzt Praktikum mache, wird eine Reverse Transkriptase mit RNAse-H-Aktivität eingesetzt, nach Manual wird dadurch eine höhere Sensitivität erzielt.
Die cDNA, die im zweiten Praktikum hergestellt wird, wird für eine quantitative-Real-Time-PCR eingesetzt.
Hat das was damit zu tun?
Im Experimentator steht drin, Reverse Transkriptasen mit RNAse-H-Aktivität seien für lange mRNAs besser, weil sie die mRNAs nicht so leicht degradieren.
Weshalb wird dann aber im Praktikum mit qRT-PCR eine RT mit RNAse-H-Aktivität eingesetzt? Hat man Angst, eine RT ohne RNAse-H würde die mRNAs mehrmals abschreiben und so die Messung torpedieren?
Und setzt man bei qRT-PCRs i.d.R. die Primer so an, dass das Transkript recht klein ist? Also so um die 100bps oder so?
Als ich cDNAs qualitativ nachgewiesen habe, waren die Transkripte nämlich recht lang (Taq-Pol, ca. 900bp).

Gruß, Stefan

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Hallo!

Kann mir einer sagen, was es dabei auf sich hat, ob eine
Reverse Transkriptase nun noch eine RNAse-H-Aktivität hat oder
nicht?

Meines Wissens nach ist die RNAseH nur dann wichtig, wenn sich der DNA:RNA-Hybrid nicht für eine spätere Analyse eignet. In der PCR wird ja sowieso erst denaturiert, da ist es also nicht notwendig, eine RT mit RNAse-Aktivität zu verwenden.

Was ich mir vorstellen kann, ist, dass RTs mit RNAseH eine etwas höhere Prozessivität haben und so sehr lange RNAs besser (vollständiger und effizienter) umschreiben können. Das ist für Klonierungen wichtig.

Die cDNA, die im zweiten Praktikum hergestellt wird, wird für
eine quantitative-Real-Time-PCR eingesetzt.
Hat das was damit zu tun?

Meines Erachtens kaum. Die Probenaufarbeitung (-> RNA-Qualität) und die Art des Primings (oligo-dT oder Random-Hexamere oder Target-spezifisch) haben einen größeren Einfluss auf die Sensitivität.

Im übrigen ist die Sensitivität für die quantitative real-time-PCR überhaupt nicht das Problem! Das ist vielen nicht klar. Eine Hohe Sensitivität brauchst du nur dann, wenn du nachweisen willst, DASS ÜBERHAUPT wenigstens ein Zielmolekül im Ansatz war. Wenn tatsächlich nur sehr wenige Moleküle da sind, dann macht eine Quantifizierung in aller Regel keinen Sinn, weil die Fehler gigantisch sind. Also: selbst, wenn durch eine unsensitive RT 50% der mRNAs nicht umgeschrieben werden, dann würde das den Ct-Wert ja nur um einen Zyklus nach hinten schieben. Wenn DAS dann ein Problem ist, dann ist die Quantifizierung mit einer supersensitiven RT auch nicht viel besser!

Hat man Angst, eine RT ohne
RNAse-H würde die mRNAs mehrmals abschreiben und so die
Messung torpedieren?

Keine Ahnung, wovor deine Kursleiter Angst haben… :wink:

Und setzt man bei qRT-PCRs i.d.R. die Primer so an, dass das
Transkript recht klein ist? Also so um die 100bps oder so?

Korrekt. Es ist wichtig, hohe Amplifikationseffizienzen zu erreichen, um sinnvoll quantifizieren zu können. Eigentlich ist das Prinzip der Quantifizierunge genauer, wenn die Effizienzen geringer sind (warum wohl?) - aber wenn die Amplifikation suboptimal läuft, gibt es leicht Unterschiede von reaktion zu Reaktion, und Reaktionen mit unterschiedlichen Effizienzen lassen sich nicht miteinander vergleichen (worauf ja letzlich die Quantifizierung beruht). Also rährt man die Reaktionen sozusagen „an die Wand“, so dass die Effizienzen überall optimal sind, nämlich bei 2 liegen. Solche Reaktionen sind dann idR auch robust und die Effizienzen schwanken eben nicht so.

Als ich cDNAs qualitativ nachgewiesen habe, waren die
Transkripte nämlich recht lang (Taq-Pol, ca. 900bp).

Mhm, für ene real-time-PCR ist das viel zu lang.

LG
Jochen