Hallo,
angenommen ich will an einem Organismus arbeiten, der noch nicht sequenziert ist. Ich will eine Klonierung in E.Coli durchführen. Da muss ich ja erstmal das Gen kennen und dann das Gen mit PCR anhäufen und dann einbauen in einen Vektor.
Wo bekomme ich das Gen im Vorhinein denn her? Und wie füge ich da ein Split-YFP z.B. dran? Und woher weiß ich an welcher Stelle ich das YFP splitten kann sodass es noch mit der anderen Hälfte reagieren kann?
Wenn ein bestimmtes Gen aus einem Organismus sequenziert werden soll, dessen Genom noch nicht sequenziert ist, kann man versuchen Sequenzen des Genes von mehreren möglichst näher verwandten Organismen per Datenbanken zu suchen. Vergleicht man die Sequenzen dieser in Bezug auf die DNA nahe der zu untersuchenden Genes, kann man oft konservative Bereiche identifizieren, in denen wenige Mutationen auftreten und die sich daher gut eignen um Primer für das Gen in Frage zu designen. Diese können dann in einer PCR eingesetzt werden, um das Gen zu amplifizieren. Es kann hier natürlich immer passieren, dass die Primer nicht so gut funktionieren wie erhofft, da der Organismus ja noch nicht bekannt ist, aber falls die Primer nicht funktionieren, kann man diesen Prozess ggf.wiederholen. Falls es gelingt das Gen zu amplifizieren (inklusive anschließender DNA-Abschnitte) kann man anschließend spezifische Primer designen.
Bezüglich der Lokalisation des Flouresensmarkers gibt es verschiedene Punkte zu beachten. Falls eine die Interaktion von zwei Proteinen untersucht werden soll, sind strukturelle Informationen des Proteins hilfreich um eine geeignete Stelle für den Marker zu finden. Hier könnten vielleicht auch die Sequenz des Gens oder Proteine von verwandten Organismen analysiert werden, um die Struktur des Proteins zu antizipieren. Hier kann man aber auch verschiedene Kombinationen ausprobieren. Zweitens sollte der Marker nicht die Lage, Stabilität oder Expression des Gens beeinflussen. Und natürlich sollte der Marker nicht die biologische Funktion des Proteins beeinflussen. Das letzte kann man leider nur überprüfen durch Essays, welche bekannte Funktionen des Proteins überprüfen.
Hi
Das Split-YFP ist schon publiziert:
Plant Physiology 145:1090-1099 (2007) und darin zitiert: Ghosh I, Hamilton AD, Regan L (2000) Antiparallel leucine zipper-directed protein reassembly: application to the green fluorescent protein. J Am Chem Soc 122: 5658–565
Hu CD, Chinenov Y, Kerppola TK (2002) Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell 9: 789–798
Das bedeutet, du fragst bei den Autoren nach den entsprechenden DNA-Sequenzen, sie müssten dir die Plasmide sogar zur Verfügung stellen können.
Oder du klonierst dir zuerst das zusammen, die Sequenzen sind dann ja publiziert.
Ursprünglich wird wohl jemand anhand der YFP-Kristallstruktur oder Strukturmotiven (der Aminosäurensequenz) überlegt haben, wo er es denn splitten könnte und dann verschiedene Kombinationen ausprobiert.
so. nun zu deinem Gene of interest:
Wenn dein Organismus noch nicht sequenziert ist, dann musst du das Gen auf die herkömmliche Art und Weise identifizieren, d.h. mit einer Klonbank (dazu ist keine PCR nötig. Du kannst ja eine genomische oder noch besser eine cDNA-Bank herstellen) und z.B. einem Funktionellen test. Wenn das nicht geht, hast du Schwierigkeiten, an die Sequenz heranzukommen.
Mal angenommen das sei aber möglich möglich. Dann machst du ab dem Library-Klon eine PCR mit Primern, die am Ende entsprechende Restriktionsstellen enthalten, die dein Gen dann passgenau (d.h. so dass kein Frameshift entsteht) in das Split-YFP-Plasmid einfügen.
Viel Spass bei der Theorie oder Praxis
Susanne
Das ist richtig, du muesstest das Gen kennen da du Primer herstellen musst die das gesamte Gen einschliessen. Suche im Internet homologe Gene (vielleicht in anderen Organismen) woraus du eventuell mehr Informationen gewinnen kannst bezueglich der Sequence. Die PCR wuerde ich dann von cDNA starten die durch aus der Umwandlung von mRNA gewinnst. Ich bin mir nicht ganz sicher was du mit Split-YFP meinst. Moechtest du ein Signalmolekuel einbauen um das Protein unter dem Mikroskope zu sehen? Oder es eventuell saeubern/precipitieren bei Verwendung des Signalmolekuels?
Hallo joyner, es gibt wahrscheinlich Homologien zu anderen Organismen, dh Sequenzähnlichkeiten. Darauf basierend kannst Du dann eine PCR für das Gen in Deinem Orgnismus machen, dann die DNA zu einem Ring schliessen (siehe auch chemgapedia Gensuche) und nach aussen sequenzieren. Bezüglich split yfp siehe wikipedia BiFC. LG M
ist das suchen eines homologen gens in einer datenbank schwer? braucht man da bestimmte kenntnisse um das gen zu finden oder ist es machbar?
ist das suchen eines homologen gens in einer datenbank schwer? braucht man da bestimmte kenntnisse um das gen zu finden oder ist es machbar?
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ist das schwer sowas in einer datenbank zu finden, braucht man dazu kenntnisse wie man sowas macht?
Die Frage ist unfaehr gestellt, fuer einen Experten der das woechentlich macht ist es/ sollte es keine grossen Probleme darstellen. Und natuerlich braucht man dazu Kenntnisse. Als Student in den ersten Jahren haett ich wahrscheinlich ewig dafuer gebraucht bloss weil es mir an Erfahrung fehlte. Aber natuerlich ist es machbar!
ist das schwer sowas in einer datenbank zu finden, braucht man
dazu kenntnisse wie man sowas macht?
Hallo,
es stimmt, der erste Schritt ist die PCR. Dafür brauchst du nicht das Gen sondern nur die Sequenz deines gewünschten Gens und die Größe. Dann kannst du Primer bestellen, die komplementär zum Genanfang und Genende sind und dann würdest du eine PCR machen mit deinem gewünschten Organismus als Template. Meist macht man dazu eine Kolonie-PCR.
Für das YFP gibt es mehrere Möglichkeiten. Ich arbeite damit nicht, denke aber, dass es bestimmt einen kommerziellen Vektor gibt, auf dem YFP schon drauf ist. Den würdest du dann zum Klonieren verwenden. Vielleicht gibt es auch im Labor bereits Konstrukte mit YFP, dann könntest du es umklonieren. Schließlich kann man auch, wenn die Sequenz kurz ist, die Sequenz gleich mit an den Primer für die PCR dranbasteln (also erst die Sequenz für das Genende und dann ohne Stoppcodon YFP drann und das Stoppcodon dann dahinter. Mit dem Splitten kenne ich mich nicht aus. Was soll das sein? Ich vermute, dass du nur einen Teil der YFP-Sequenz verwenden willst. Dann müsstest du wissen, welche Sequenz essentiell ist für die Funktion. Da gibts bestimmt Literaturangaben.
Grüße
Christine
Hallo Joyner,
da gibt es mehrere Möglichkeiten zu… jenachdem was du brauchst bzw. mit welchem Organismus ihr arbeitet. Zur genauen Antwort müsste man mehr wissen. Ich erkläre im folgenden eine mögliche Strategie:
1.) Isolation des Genes aus dem organismus.
Hier gibt es 2 möglichkeiten, isolation von genomischer DNA oder isolation von aktiv exprimierten genen (CDNA). Beides ist nicht trivial, aber möglich - die Fragmente werden dann in Plasmide oder cosmide geklont und enthalten im optimalfall alle nötigen informationen. (bezeichent man als Bibliothek)
e.v können solche Bibliotheken auch für deinen organismus bezogen werden und müssen nicht selbst erstellt werden.
2.) Identifikation des Genes aus der Bibliothek - vieles ist möglich, mir bekannt sind for allem Methoden des „fishing“, d.h. mit primersequenzen die ähnlich der erwarteten gen-sequenz sind, „fischst“ du nach einer PCR bande deines genes (konservierte regionen). Diese wird sequenziert, und von da aus dann die ganze Sequenz des Genes gefunden. (optimalfall)
3.) die Sequenz wird künstlich geordert (heute meist günstiger) oder in einen e.coli-vektor deiner wahl kloniert. Falls das gen splicing-stellen hat, müssen dies entfernt werden, bei CDNA muss sichergestelt werden, dass die komplette Sequenz vorhanden ist.
Dann hast du das Gen in e.coli, und vielleicht ist es auch aktiv 
Split-YFP: Falls sich dies auf einen Reportermethode durch einführen von YFP bezieht, habe ich diese noch nicht genutzt und kann sie nicht erklären. Als guter startpunkt eignet sich einen Pubmed-suche nach YFP oder ähnliches.
viel Erfolg
Xan
Hallo, auf deine Frage kann ich dir leider nicht weiterhelfen.
Hi,
geht es Dir um eine spezielle Anwendung, oder fragst Du rein aus Interesse? Wenn ja, solltest du deine Fragen noch ein wenig besser präzisieren. Allgemein wird bei einer Klonierung das Ziel verfolgt einen Organismus entweder mit einer zusätzlichen Funktionalität auszustatten, diese zu entfernen, bzw. herauszufinden, ob das Genprodukt in Wechselwirkung mit anderen Proteinen tritt. Daher ist das Gen in der Regel bekannt. Zu Deiner Frage: das Gen, welches kloniert werden soll, wird zunächst aus einem Donororganismus, in der Regel durch eine Amplifikation wie z.B. eine PCR isoliert, in einen Vektor einkloniert und der Empfängerorganismus mit diesem Vektor transformiert. Das Gen stammt also meist aus einem anderen Organismus. Wie ein solches Gen identifiziert wird, also welches Gen für welchen Phänotyp, bzw. welche Funktionalität kodiert, ist nochmal ein Themengebiet für sich.
Da Du nach dem Split-YFP Reportersystem fragst, gehe ich davon aus, du willst eine Wechselwirkung zwischen Proteinen identifizieren. Soweit ich weiß werden entsprechende Split-YFP Vektoren komerziell vertrieben. Beim Einklonieren Deines Zielgens in einen solchen Vektor wird dieses mit einer Untereinheinheit des YFPs verknüpft, sodass nach der Translation beide Teile (Zielgen + Reporter) kovalent miteinander verbunden sind. Die zweite Untereinheit muss nach demselben Prinzip mit dem erwarteten Counterpart verbunden werden. Treten dann beide Komponenten (Zielgen+Counterpart) in Verbindung, verbinden sich auch die beiden YFP Untereinheiten und die Wechselwirkung kann unter UV Licht detektiert werden. Ob es eine effiziente Methode gibt, solche Schnittstellen zu finden, weiß ich nicht. Zur Not halt über Try’n’Error alle möglichen Schnittstellen ausprobieren und schauen, ob sich die Untereinheiten wieder spontan zusammenlagern und ihre Funktionalität wiederherstellen können.
Ich hoffe ich konnte Dir weiterhelfen.
Hallo,
weiß ich nicht, sorry.