Ein fröhliches „Hallo“ an alle Hilfewütigen!
Ich bin gerade dabei die Realtime-PCR als eine neue Methode in unseren Laboren zu etablieren. Dieses soll mit Hilfe von Taqman-Sonden erfolgen. Ich habe nun bereits eine Plasmidverdünnungsreihe zur Entwicklung des Standards hergestellt und wollte nun die besten Bedingungen für die Amplifikation der PCR-Fragmente finden. Nach meinen bisher gewählten Bedingungen erhielt ich zwar Amplifikate aber zwischen den Plasmidverdünnungen von einer Zehnerpotenz lagen immer 5 Zyklen anstatt der vorgeschriebenen 3 und außerdem hatte ich keine Amplifikate mehr bei den eingestzten Kopienzahlen meines Fragmentes von 10-3 bis 10-1. Meine frage ist nun: In welche Richtung eignet sich eine Optimierung der Realtime-PCR, damit ich 1. auch geringe Kopienzahlen amplifizieren und 2. die gewünschte Zyklenzahl (ct) von 3 erhalte zwischen den einzelnen Zehnerverdünnungsstufen. Da in meinem Handbuch drin steht, dass es alles sein kann, wollte ich einfach einmal fragen, ob jemand vielleicht mir einen Tipp geben kann, womit man am besten anfängt.
Viele Grüße Ingo
Hi Ingo,
etwas verwirrend ist der Text ja leider schon irgendwie. Wenn ich das richtig verstanden habe, hast du lediglich eine Effizienz von ca. 60% und daher auch die 5 Zyklen-Unterschied. Wie kann man denn bitte 10^-3 bzw. 10^-1 Kopie einsetzen? Wenn das Absolutwerte sind wären das 0.1 bzw. 0.001 Kopien…
Die Effizienz der PCR hängt leider wie in deinem Handbuch beschrieben von vielen Faktoren ab und ist daher nur schwer aus der Ferne zu optimieren. Oftmals sinds aber einfach nur die Primer bzw. deren Annealingtemp bzw. die verwendete Polymerase. Die Sonden sind ja für das Ampifikat optimiert und sollten somit für die Effizienz nicht relevant sein.
Hast du vielleicht noch genomische DNA bzw. total-RNA im Mix? Was für RNA benutzt du überhaupt? Total oder aufgereinigte mRNA?
Laut Invitrogen-Troubleshooting gibts ein paar Möglichkeiten für zu spätes Auftauchen der Proben:
https://catalog.invitrogen.com/index.cfm?fuseaction=…
Product detected at higher than expected cycle number
-
RNA has been damaged or degraded -> Replace RNA if necessary.
-
RNase contamination -> Maintain aseptic conditions; add RNase inhibitor.
-
RT inhibitors are present in RNA -> Remove inhibitors in the RNA preparation by an additional 70% ethanol wash. Inhibitors of RT include SDS, EDTA, guanidium salts, formamide, sodium phosphate and spermidine
-
Inefficient cDNA synthesis -> Adjust cDNA synthesis temperature and/or primer design.
-
Inefficient PCR amplification -> Optimize PCR conditions:
Adjust annealing temperature as necessary.
Increase magnesium concentration.
Redesign primers.
Eine „einfache“ PCR und anschließende Konzentrationsbestimmung des Ansatzes nach vorher genau festgelegten Zyklen wäre auch eine Möglichkeit die Primer zu überprüfen. Z.B. nach 17,20 und 25 Zyklen die Konz. messen und schauen wann sich die Menge verdoppelt hat.
Ansonsten hätt ich im Moment keine weiteren Anmerkungen 
Gruß, Steffen
[Bei dieser Antwort wurde das Vollzitat nachträglich automatisiert entfernt]
Ein fröhliches „Hallo“ an alle Hilfewütigen!
Ich bin gerade dabei die Realtime-PCR als eine neue Methode in
unseren Laboren zu etablieren. Dieses soll mit Hilfe von
Taqman-Sonden erfolgen. Ich habe nun bereits eine
Plasmidverdünnungsreihe zur Entwicklung des Standards
hergestellt und wollte nun die besten Bedingungen für die
Amplifikation der PCR-Fragmente finden. Nach meinen bisher
gewählten Bedingungen erhielt ich zwar Amplifikate aber
zwischen den Plasmidverdünnungen von einer Zehnerpotenz lagen
immer 5 Zyklen anstatt der vorgeschriebenen 3 und außerdem
hatte ich keine Amplifikate mehr bei den eingestzten
Kopienzahlen meines Fragmentes von 10-3 bis 10-1. Meine frage
ist nun: In welche Richtung eignet sich eine Optimierung der
Realtime-PCR, damit ich 1. auch geringe Kopienzahlen
amplifizieren und 2. die gewünschte Zyklenzahl (ct) von 3
erhalte zwischen den einzelnen Zehnerverdünnungsstufen. Da in
meinem Handbuch drin steht, dass es alles sein kann, wollte
ich einfach einmal fragen, ob jemand vielleicht mir einen Tipp
geben kann, womit man am besten anfängt.
Viele Grüße Ingo
Hi Ingo,
etwas verwirrend ist der Text ja leider schon irgendwie. Wenn
ich das richtig verstanden habe, hast du lediglich eine
Effizienz von ca. 60% und daher auch die 5 Zyklen-Unterschied.
Wie kann man denn bitte 10^-3 bzw. 10^-1 Kopie einsetzen? Wenn
das Absolutwerte sind wären das 0.1 bzw. 0.001 Kopien…
Die Effizienz der PCR hängt leider wie in deinem Handbuch
beschrieben von vielen Faktoren ab und ist daher nur schwer
aus der Ferne zu optimieren. Oftmals sinds aber einfach nur
die Primer bzw. deren Annealingtemp bzw. die verwendete
Polymerase. Die Sonden sind ja für das Ampifikat optimiert und
sollten somit für die Effizienz nicht relevant sein.
Hast du vielleicht noch genomische DNA bzw. total-RNA im Mix?
Was für RNA benutzt du überhaupt? Total oder aufgereinigte
mRNA?
Laut Invitrogen-Troubleshooting gibts ein paar Möglichkeiten
für zu spätes Auftauchen der Proben:
https://catalog.invitrogen.com/index.cfm?fuseaction=…
Product detected at higher than expected cycle number
-
RNA has been damaged or degraded -> Replace RNA if
necessary.
-
RNase contamination -> Maintain aseptic conditions; add
RNase inhibitor.
-
RT inhibitors are present in RNA -> Remove inhibitors in
the RNA preparation by an additional 70% ethanol wash.
Inhibitors of RT include SDS, EDTA, guanidium salts,
formamide, sodium phosphate and spermidine
-
Inefficient cDNA synthesis -> Adjust cDNA synthesis
temperature and/or primer design.
-
Inefficient PCR amplification -> Optimize PCR
conditions:
Adjust annealing temperature as necessary.
Increase magnesium concentration.
Redesign primers.
Eine „einfache“ PCR und anschließende Konzentrationsbestimmung
des Ansatzes nach vorher genau festgelegten Zyklen wäre auch
eine Möglichkeit die Primer zu überprüfen. Z.B. nach 17,20 und
25 Zyklen die Konz. messen und schauen wann sich die Menge
verdoppelt hat.
Ansonsten hätt ich im Moment keine weiteren Anmerkungen
Gruß, Steffen
Hallo Steffen,
vielen Dank für die hilfreichen Tipps. Also Du lagst mit Deiner Vermutung ganz richtig, dass meine PCR-Effizienz nur bei ca. 60 Prozent liegt. Mit den Zahlen das meine ich so, dass ich ab einer Anzahl von 1000 Kopien je Probe keim Amplifikationssignal bekommen habe. Das war wirklich etwas verwirrend geschrieben – sorry. Ich denke, dass ich zunächst einmal die Primerkonzentrationen variieren werde und wenn das nicht hilft eine Erhöhung der Mgcl2 Konzentration vornehmen. Die Annealing-T finde ich eigentlich optimal gewählt aber auch dort könnte man es noch einmal mit einer Optimierung versuchen. Was meinst Du, würden PCR-Beschleuniger wie DMSO, Glyzerin, Formamid oder Tween 20 etwas bewirken können? Oder sollte man solche Zusätze in der Realtime eher meiden?
Ok, dann werde ich mich mal an die Arbeit machen!
Viele Grüße, Ingo
Hallo Steffen,
vielen Dank für die hilfreichen Tipps. Also Du lagst mit
Deiner Vermutung ganz richtig, dass meine PCR-Effizienz nur
bei ca. 60 Prozent liegt. Mit den Zahlen das meine ich so,
dass ich ab einer Anzahl von 1000 Kopien je Probe keim
Amplifikationssignal bekommen habe. Das war wirklich etwas
verwirrend geschrieben – sorry. Ich denke, dass ich zunächst
einmal die Primerkonzentrationen variieren werde und wenn das
nicht hilft eine Erhöhung der Mgcl2 Konzentration vornehmen.
Die Annealing-T finde ich eigentlich optimal gewählt aber auch
dort könnte man es noch einmal mit einer Optimierung
versuchen. Was meinst Du, würden PCR-Beschleuniger wie DMSO,
Glyzerin, Formamid oder Tween 20 etwas bewirken können? Oder
sollte man solche Zusätze in der Realtime eher meiden?
Ok, dann werde ich mich mal an die Arbeit machen!
Viele Grüße, Ingo
Hehe auch hier wieder ein kleiner Denkfehler wie mir scheint
Du meinst wohl eher unterhalb von 1000 Kopien kriegst du kein Signal mehr. Kann mir nämlich beim besten Willen nicht vorstellen daß zuviel Template die PCR unterbinden soll. Es sei denn natürlich du hast dir so eine doofe Sequenz ausgesucht, daß du homologe Sequenzen hast, sodaß sich bei zu hoher Konz. die Templates zusammen lagern.
Primerkonzentration und MgCl2 ist schon mal ein guter Ansatz. Da oftmals aber die Primer selbst zicken, wäre ein neues Set Primer auch eine Überlegung wert. Hierbei würde ich unbedingt auf computerunterstütze Auswahl der Primer setzen. Aus eigener Erfahrung sind die Progamme einfach besser als man selbst mit der Hand und dem Taschenrechner
Wünsche noch viel Erfolg bei deiner PCR.
Was DMSO, Glycerin, Tween20 und so angeht muss ich leider passen. Hab ich mich nie wirklich mit befasst.