Vorgang einer PCR

Wissenschaft Biologie
#1

Hi,
bei uns ist gerade eine Grundsatzdiskussion darüber entbrannt, ob man die RNA-Menge nach der Isolierung photometrisch bestimmen muß oder nicht, weil ja schließlich das spezifische Produkt gegen ein Housekeeping-Gen abgeglichen wird. Dieses Gen (z.B. GAPDH) ist ja genauso abhängig von der Menge isolierter RNA wie das spezifische Produkt.
Soll heißen, wenn ich tatsächlich unterschiedliche Mengen Template generiere, weil meine RNA-Menge unterschieldich war, sollte dies durch die Relation zur GAPDH doch „ausgebügelt“ werden, oder?

Bin gespannt auf Deine Antwort.
Gruß Michael

#2

ich befürchte ich kann deine frage nicht beantworten, sie stammt offensichtlich nicht aus meinem fachgebiet
Hi,
bei uns ist gerade eine Grundsatzdiskussion darüber entbrannt,
ob man die RNA-Menge nach der Isolierung photometrisch
bestimmen muß oder nicht, weil ja schließlich das spezifische
Produkt gegen ein Housekeeping-Gen abgeglichen wird. Dieses
Gen (z.B. GAPDH) ist ja genauso abhängig von der Menge
isolierter RNA wie das spezifische Produkt.
Soll heißen, wenn ich tatsächlich unterschiedliche Mengen
Template generiere, weil meine RNA-Menge unterschieldich war,
sollte dies durch die Relation zur GAPDH doch „ausgebügelt“
werden, oder?

Bin gespannt auf Deine Antwort.
Gruß Michael

#3

In der Theorie hast du soweit sicherlich recht, es ist nicht zwingend notwendig die RNA Menge zu bestimmen. Allerdings empfehle ich trotzdem immer die Messung, wenn man genug RNA Ausbäute hat. Bei der photometrischen Messung bekommt man ja bei den meisten Gräten neben der RNA Konzentration auch noch eine 260nm/280nm Ratio, die Rückschlüsse auf die RNA Qualität zulässt.
Außerdem ist mir persönlich wichtig, dass ich weiß, wie effizient meine RNA Isolation war, um eventuelle Protokolloptimierungen zu kontrollieren. Ein weiterer Vorteil ist, dass beim Einsetzen von gleichen Mengen RNA in die cDNA Synthese bereits die Tendenz des Experiments an den Rohdaten zu erkennen ist.

Problematisch wird es, wenn man zu viel RNA in die cDNA Synthese einsetzt, denn das macht die Reaktion ineffizient.

Mein Fazit also: Ich würde die RNA Konzentration auf jeden Fall messen, schon alleine um zu wissen, ob ich überhaupt RNA isoliert habe.

#4

Hallo Michael,

ich würde die isolierte RNA aus mehreren Gründen vermessen um die Konzentration einstellen zu können.

  1. Die cDNA-Synthese ist limitiert auf bestimmte Konzentrationen von eingebrachter RNA. Abhängig von der eingesetzten Methode. Wenn zu viel RNA eingesetzt wurde, wird nicht alles im selben Verhälnis umgeschrieben. So kann es passieren, dass z.B. GAPDH bevorzugt synthetisiert wird und das Zielgen z.B. aufgrund von längerer Sequenz nicht komplett umgeschrieben werden kann, da die Reagenzien wie Nukleotide, Primer, Reverse-Transkriptase vorab verbraucht sind.
  2. Die quantitative-PCR hat auch ein Konzentrations-Optimum. Dies muss vorher ausprobiert werden, bei welcher cDNA Konzentration die beste Amplifikationseffizienz für beide Gene erzielt werden kann. Ist die Effizienz des Zielgens besser als die von GAPDH sind die Daten nicht miteinander vergleichbar.

Der Hauskeeper dient eigentlich nur dazu, um Schwankungen der RNA-Qualität (degradiert, und von Probe1 zu Probe2), Laufunterschiede (von Probe zu Probe bzw. von Lauf zu Lauf), verschiedene Reagenzienchargen, etc auszugleichen. Die cDNA Synthese läuft auch nie zu 100% ab (Effizienz ca. 60-80%). Heißt es wird nie die gesamte RNA zu cDNA. Da dies aber nicht bzw nur schwer bestimmt werden kann, muss man sich dieses Tricks bedienen um verschiedene Proben miteinander vergleichen zu können.

Ich hoffe ich konnte damit erst mal helfen. Viele Grüße oli

#5

Hallo Michael,

meine letzte cDNA-Synthese ist schon eine Weile her, allerdings habe ich immer die RNA-Konzentration und Reinheit bestimmt und dann immer die gleiche Menge in die cDNA-Synthese eingesetzt. Wir haben für die Real time ß-Actin als Housekeeper genommen. Natürlich hast Du recht, dass alle Faktoren das Housekeeping-Gen genauso betreffen wie das eigentliche Target. Dennoch denke ich, dass eine standardisierte Prozedur bei einer so Fehleranfälligen Methode wie Real time nicht schaden kann.

LG,
Julia