Was passiert mit toten Zellen in der Zellkultur?

Wissenschaft Biologie
#1

Hallo,

ich hab ein Zellkulturpraktikum gemacht, in dem ich Zellen eingefroren haben, wieder aufgetaut und dann die Zellzahl von lebenden und toten Zellen direkt nach dem auftauen und nach 1 Tag Inkubationszeit gemessen habe.

Nach 1 Tag Inkubationszeit, habe ich aber sehr sehr viel weniger tote Zellen in der Lösung.

Meine Frage ist, was ist mit diesen toten Zellen passiert? lösen sich diese auf, bzw. werden sie so schnell abgebaut oder zerreißt es sie bei der Zentrifugation (es würde Zentrifugiert bei 1 000 rpm für 5 min bei 4°C)

Danke für alle Anregungen und Antworten

#2

Hallo Kuschelkowu,

handelt es sich denn bei deinen Kulturen um Suspensionszellen oder adherente Zellen?
Wie hast du denn die Vitalität bestimmt?

LG

#3

Es handelt sich um adherente NIH-3T3-Zellen und die Vitalfärbung war mit Trypanblau

(Der Inhalt des Einfrierröhrchens wurde nach dem auftauen mit Medium verdünnt, und alles Zentrifugiert bei 1000 rpm, 5 min, 4°C und davon 100 µl Suspension mit 100 µl Trypanblau gefärbt und ausgezählt. Der Rest wurde inkubiert und nach 24 h wurde das Medium abgesaugt, Zellen gewaschen, trypsiniert und alles was abgenommen wurde und die Zellen in der Flasche zentrifugiert bei 1000 rpm, 5 min, 4°C und genauso wieder mit trypanblau ausgezählt.)

Die lebenden Zellen haben sich verdoppelt, aber die toten Zellen sind von 1,5*10^5 (nach auftauen) auf 6*10^4 abgerutscht und ich steh vor dem Rätsel wo meine 9*10^4 toten Zellen von Tag zuvor abgehauen sind.

#4

Hallo,

das ist wirklich eine sehr interessante Frage, die mich auch verwundert. Ich kann dir leider keine Antwort auf deine Frage geben. Ich arneite auch mit Krebszellen, die ich auftaue und einfriere und zwischendurch in Zellkurlutflachen wachsen lasse…aber ich habe noch nie die Zellzahl nach dem Auftauen und einige Tage danach gezählt und miteinander verglichen…ich hab keine Ahnung und würde die Antwort auch gerne wissen. Kannst mir ja, wenn du möchtest, auch die Antwort schicken, falls dir jemand anders die Frage beantworten kann.

Viele Grüße

#5

Hi kuschelkowu,

die Frage ist nicht pauschal zu Beantworten, solange man nicht den genauen Versuchsaufbau kennt. Allerdings ist der natürliche Vorgang immer der selbe:
Sobald Zellen sterben, können sie den Natrium/Kalium -Gradienten, der normalerweise über jeder Zellmembran herrscht und der durch die gleichnamige ATPase mehr oder weniger konstant gehalten wird, nicht mehr aufrecht erhalten.
Die Folge davon ist, dass Wasser in die Zellen einströmt und sie platzen.
In wie weit die toten Zellen danach noch enzymatisch abgebaut werden, hängt sowohl von der benutzten Zellart als auch vom Nährmedium ab.

Ich hoffe die Frage ist ausführlich genug beantwortet, wenn du noch etwas genauer wissen willst, sag einfach Bescheid.

Schönen Sonntag noch,
Alex

#6

Hi,

also zunächst einmal werden tote Zellen nicht mehr adhärent und schwimmen deshalb im Medium frei herum. Beim Mediumwechsel werden daher schon eine Menge toter Zellen ausgewaschen.
Wenn Zellen sterben, gibt es zwei anerkannte Varianten des Zelltodes: 1.) ungewollte Apoptose: die Zellen wird derart geschädigt durch äußere Einwirkungen, Scherkräfte, mechanische Verletzungen, Krankheitserreger wie Viren, die die Zellen zur Produktion neuer Viren umgepolt haben und die Zelle zum Platzen bringen. Dies hat zur Folge das Botenstoffe aus der Zelle freigesetzt werden, was weitere Zellen absterben läßt. 2.) Nekrose, der programmierte Zelltod. Eine Zelle erhält ein internes Signal, dass sie absterben soll. In diesem Falle zerplatzt die Zelle nicht sondern zerfällt letztlich in einzelne Zellmembran-umschlossene Kompartimente, die ohne andere Zellen zu beeinflussen rasch von Makrophagen abgebaut werden können. Ob dieser Vorgang in einer Reinkultur (z.B. Fibroblasten) vergelichbar abläuft, weiß ich nicht, da dort ja keine Makros sein sollten. Zumindest könnte die kleineren Fragmente eine mögliche Erklärung sein, weshalb Du weniger tote Zellen sehen kannst.

Gruß
Michael

#7

Hallo, Zellen enthalten Vessikel /Bläschen mit Lysozymen (Proteasen). Nach dem Tod der Zelle sind sie nicht mehr verschlossen und lösen die tote Zelle auf. Gefärbt und damit detektiert werden kann die Zelle nur kurze Zeit nach dem Tod.

Durch Zentrifugation können Zellen grundsätzlich auch zerreissen (zB wenn Du Blut abzentrifugierst);( rpm musst Du immer in g („rcf“) über die Rotorgrösse umrechnen, „1000 rpm“ hat keine Aussage) - ich nehme mal an, dass das hier nicht der Fall war.

#8

Hallo Kuschelkowu,

Beim Einfrieren kann es natürlich passieren, dass Zellen absterben. Wie wurden die denn weggefroren? Eigentlich sollten nicht so viele Zellen tot sein, nach dem Auftauen.

Wenn du sie anschließend inkubierst, wachsen bei einer adherenten Kultur ja die vitalen Zellen an und wachsen ja auch weiter (deswegen verdoppeln sich deine lebenden Zellen). Die toten Zellen wachsen nicht an und schwimmen als „Zellschrott“ im Medium - was du ja vor der Trypsinierung wegsaugst und somit nicht mehr zählen kannst.

Gucke dir doch beim nächsten Mal deine Zellkultur an, bevor du das Medium absaugst, dann solltest du die toten Zellen als Zellschrott im Medium schwimmen sehen. Du kannst natürlich auch eine Färbung mit Trypanblau vom Medium machen.

Mich wundert aber trotzdem, dass du so viele tote Zellen nach den 24h zählst - bei uns liegt die Vitalität meist bei über 90%…

Ich hoffe deine Fragen sind damit beantwortet, viel Spaß weiterhin!

Tinkabell

#9

Also innerhalb eines Tages passiert normalerweise nicht sehr viel mit den Toten Zellen, aber das ist sehr stark vom Zelltyp abhängig. Gehe ich richtig in der Annahme, dass Du die Zellzahl der lebenden/toten Zellen pro ml in der Zählkammer gezählt hast? Dann würde ich eher darauf tippen, dass die lebenden Zellen sich rasant vermehrt haben und daher im Verhältnis wesentlich weniger tote Zellen vorhanden waren.
Ich mache regelmäßig die Erfahrung, dass auch tote Zellen sich in der Zellkultur halten, teilweise über mehrere Wochen. sind jedoch genug lebende, proliferierende Zellen darunter, werden die toten Zellen sehr schnell herausverdünnt.
Bei der Zentrifugation können schon auch genug Kräfte entstehen, die tote Zellen in Fragmente zerlegen, das habe ich allerdings nie bewusst beobachtet.

#10

Hallo,

die Zellwand oder -membran wird nach dem Tod zunächst „krumpelig“, die Zellen zerfallen immer mehr und sind dann als Bruchstücke im Medium sichtbar (kleinere schwarze Teichen). Beim Passagieren (also beim Umsetzen der Zellen in frisches Medium) werden die Zelltrümmer der toten Zellen immer weiter verdünnt, da sie aufgrund ihrer geringeren Dichte nach dem Zentrifugieren über dem eigentlichen Zellpellet schwimmen und dann abgesaugt werden. Außerdem löst sich die Zelle auf. Ich hoffe, das hilft weiter.

Gruß

#11

Hallo,

ja die Zellmembran reißt auf bzw. löst sich mit der zeit auf. Bzw. wird der Zellschrott der toten Zellen beim Medienwechsel mit abgenommen.