hallo ihr lieben, nochmal kurze frage… wir wollen eine realtime pcr machen und verschiedene primerpaare testen. alle sind für das gleiche produkt designt… jetzt haben wir aber das problem, dass die Tm der Primer zwischen 50 und 67°C liegen und die Maschine nur eine Temp. kann… wir würden aber gerne alle in einem Lauf testen, also pro well ein Primerpaar… aber wie machen wir das mit der Temperatur? hätte da jemand eine Idee? Oder müssten wir doch alle einzeln in eigenen PCRs laufen lassen, bzw die mit ähnlichen Tms zusamen?Danke euch!
Hallo Anika,
ich bin etwas verwirrt. Willst du wirklich eine Multiplex-PCR machen, also mit mehreren (wie vielen?) Primerpaaren in einer Reaktion oder mehrere Primerpaare in separaten Reaktionen, aber wenn möglich im gleichen Run des selben Thermocyclers testen?
Im ersten Fall hab ich auch keinen Rat. Da werden die sehr unterschiedlichen Tm wohl Probleme bereiten.
Ansonsten gibt es noch Gradientencycler, da kann man mit etwas Geschick den Gradienten so einstellen, daß in den 12 Reihen des Cyclers auch die gewünschten Temperaturen auftreten. So ganz genau ist das aber auch nicht, wenn der Gradient nicht gut paßt.
Zu guter Letzt bleibt dann wohl nur, die Primer wirklich einzeln zu testen.
Viel Erfolg!
Eva
huhu, danke für deine antwort…ja war etwas konfus geschrieben 
nein es ist keine wirkliche multiplex pcr…sondern in jedem well auf der platte ist ein anderes primerpaar… aber unser cycler kann keinen gradienten… naja, irgendwie hat die pcr sowieso nicht geklappt… warum auch immer…nichtmal das housekeeping ist gekommen. Naja wir wiederholen das jetzt nochmal und teilen die primer in gruppen nach ähnlcihen temperaturen auf. danke trotzdem für deine hilfe!