Western Blot Transferpuffer

Wissenschaft Chemie
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Hi erstmal. Mein erster Post und ich hoffe 'ne Anregung zu finden :smile:

Ich habe momentan ein kleines „Problem“ mit einem Versuchsansatz.

Ich nutze Gewebeproben aus einer vorangegangenen Diplomarbeit. Mein Vorgänger hat seine Proteine aus einem SDS-PA-Gel auf eine Nitrozellulosemembran geblottet. Er hat einen methanolfreien Transferpuffer verwendet, eine Spannung von 100 V angelegt, mit Eis und Eisblock gekühlt und 2h aus dem Gel heraus geblottet. Alles soweit kein Problem (wobei der Powersupply nur etwa 55-70 V schafft, weil es auf 400mA beschränkt) - der Blot lief problemlos.

Ich habe dieselben Gewebeproben verwendet, denselben Tankblot, alles gleich. Trotzdem kam ich mit dem methanolfreien Puffer nur auf 21 V (bei eingestellten 100V, weil der Powersupply ja bei 400mA abriegelt). Proteine, oder überhaupt der Marker, ist natürlich nicht in die Membran übergegangen. Ich habe den Transferpuffer ohne Methanol neu angesetzt: Selbes Problem. Außerdem habe ich deutliche Aussalzungen an den Drähten.
Dann habe ich einen Transferpuffer MIT Methanol angesetzt: Ohne Probleme 50-60 V (bei 100 eingestellten), Blot lief gut, nach 2h soweit in der Membran - aber auch hier hatte ich leichte Aussalzungen an den Drähten.

Jetzt zu den Fragen :wink: :

  • Warum salzt der methanolfreie Transferpuffer stark aus?
  • Warum funktioniert der methanolfreie Puffer sowohl im alten, als auch im neuen Ansatz jetzt nicht mehr, obwohl ich EXAKT dasselbe Protokoll verwende?
  • Warum funktioniert der Methanol-Puffer deutlich besser, salzt aber auch ein wenig aus?
  • Warum erhalte ich im besten Fall nur 60 V?

Danke schonmal für eure Hilfe!

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Bin schon jahrelang nicht mehr im Labor aktiv und kann dir leider nicht helfen.

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Sorry, aber dazu fällt mir nichts Gescheites ein. Ich arbeite leider nur mit DNA/RNA…

Viel Glück noch, Nadine

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habe deine Anfrage erhalten,
bin schon ewig aus dem Thema, kann leider nicht helfen.
Viel Erfolg
Heiko

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Hallo,
mit blotten habe ich auch noch nicht sehr viele Erfahrungen gemacht, aber so wie sich das anhört hast du eine deutlich zu hohe Ionenkonzentration in deinem Puffer. Das würde einerseits dein Spannungsproblem und das Aussalzen erklären. Ich will dir nicht vor den Kopf stoßen, aber ab und zu kommt es vor, das entweder jemand das Pufferkonzentrat falsch angesetzt hat, oder bei der Einstellung auf die gebrauchsfertige Konzentration was schief gelaufen ist. Kannst du beides mit Sicherheit ausschließen?

MFG

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Hi! Daran haben wir ja auch schon gedacht. Aber wir haben fertige, funktionierende Rezepte verwendet. Und wie gesagt: Vorher funktionierte der Puffer ja auch :confused:

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Hallo,

es tut mir sehr Leid, aber ich fürchte, dass ich nicht der richtige Ansprechpartner bin. Das letzte mal im Labor stand ich vor über 4 Jahren während meiner Bachelorarbeitszeit. Ich bin mittlerweile in der Bioinformatik tätig und habe mit praktischer Laborarbeit nichts mehr tun.

Ich hoffe, dass du jemand findest, der dir weiterhelfen kann.

Viele Grüße
Björn Hansen

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Habe leider keine Antwort auf deine Frage