Hallo,
ich habe ein Problem. Seit etwa 1 Monat läuft in unserem Labor die SSP (HLA) nicht mehr richtig.
Es handelt sich bei uns teilweise um 96 spezifische Primer die mit einem Mastermix angesetzt werden.
Wir haben große Gelkammern für die gesamten 96 Primer.
Jetzt haben wir das seltsamme Phenomän, daß uns reihenweise die positiven Kontrollbanden und spezifischen Reaktionen ausfallen. Also zB 16 Primer reagieren wunderbar, dann die nächsten Komplettausfall, danach 16 gute usw.Wir haben schon fast alle Fehlermöglichkeiten ausgeschlossen und uns fällt einfach nichts mehr ein.
Falls jemand von Euch eine Idee für die Gründe von sowas hat wären wir sehr glücklich.
Zu erwähnen wäre, daß wir diese PCRs seit über 10 Jahren laufen haben und schon ziemlich fit auf dem Gebiet sind, nur im Moment absolut ratlos
Für mich hört sich das so an, als würden ca. 5% eurer PCRs nicht funktionieren, oder sind es 10% weil Ihr immer Positivkontrolle + Probe ausfallen?
Falls immer beides Ausfällt, Positivkontrolle und Probe, würde ich als erstes die Qualität der Primer in Frage stellen. Wir hatten schon mal Probleme, dass die Sequenz, die wir beim Hersteller angefordert hatten nicht korrekt synthetisiert wurde. Wir haben dann den Lieferanten gewechselt und seither keine Probleme mehr gehabt. Heutzutage kann ich mir das zwar fast nicht mehr vorstellen, da diese Firmen streng nach QM arbeiten, aber man weiß ja nie.
Gruß
Hi msteitz,
ich bin nun nicht gerade ein Experte auf dem „Single-Strand PCR“-Gebiet. Aber vielleicht fällt mir ja dennoch etwas Schlaues ein. Ich nehme an, dass ihr wohl in Einzellern genetische Sequenzen nachweisen wollt (wer macht sonst schon SSP). Da ihr ja sicherlich alle Komponenten Eures PCR-Kits schon als mögliche Fehlerquelle ausgeschlossen habt (teilweise funktioniert die PCR ja auch noch), kann es daran eigentlich ja auch nicht liegen.
Habt Ihr vielleicht mal euern Cycler geprüft? Wenn Ihr 96 Samples auf einen Schlag bearbeitet, scheint ihr also einen Thermocycler mit entsprechender „Grundplatte“ einzusetzen. Es könnte also sein, dass Euer Temperaturprofil im Cycler nicht mehr homogen ist, weil der Cycler einen Defekt hat. Je nachdem, wo die Probe stand, wird sie besser oder schlechter oder gar nicht mehr amplifiziert. Wenn Ihr könnt, sucht Euch zum Testen mal einen Alternativ-Cycler. Und ansonsten gibt es ein Meßgerät, das die Temperaturprofile jedes einzelnen Slots erfassen kann. Braucht man nicht kaufen, wenn man kein zertifiziertes Labor ist. Am besten holt man sich jemanden von z.B. Biozym, die solche Geräte verkaufen und läßt sich das Gerät mal am eigenen Cycler „vorführen“. Hat mir damals die Augen geöffnet und einen neuen Cycler beschert.
Viel Glück
Michael
Hallo,
ein paar mehr Infos wären schön zur Fehleranalyse 
Sind es regelmäßige Ausfälle also immer die gleichen 16 Positionen?
Sind die Primer in 96er Platten vorpipettiert? Wird ein Pipettierautomat benutzt? Sind es immer die gleichen Amplikons die ausfallen? Wurden die Primer schon mal wieder neu bestellt? Kommt es zu den Ausfällen bei unterschiedlichen Mitarbeitern oder macht die Arbeit einer allein?
Wenn es immer die selben Positionen betrifft, ist evtl. der Thermocycler hin. Das z.B. einige Reihen nicht mehr die Temperatur halten können.
Die Primer könnten hinüber sein oder falsch gelöst.
Das ist was mir jetzt so spontan dazu einfällt vermutlich habt ihr das schon alles ausgeschlossen.
grüsse
Ich glaube wir haben das Problem bereits gelöst.
Es lag wahrscheinlich an einer neuen Agarosecharge.
Der Gel war in der gewohnten Zeit nicht perfekt polymerisiert und hatte daher die Ausfälle.
Aber vielen Dank für Ihre Bemühungen.
Hallo,
entschuldige die späte Nachricht. Ich bin leider keine Praktikerin, deshalb kann ich eine solche Frage nicht beantworten.
Mit besten Grüßen,
Kat