kann mir jemand in kurzfassung schreiben, wie das vorgehen wäre und wo fehlerquellen liegen können´?
die Frage ist zu weit gefasst, was willst Du denn machen und warum fragst Du nach Fehlerquellen?
kann mir jemand in kurzfassung schreiben, wie das vorgehen
wäre und wo fehlerquellen liegen können´?
Sorry bin zu lange raus
Gruß Heiko
kann mir jemand in kurzfassung schreiben, wie das vorgehen
wäre und wo fehlerquellen liegen können´?
Hallo Joyner,
Das ist eine sehr allgemeine Frage. Was hast du denn an Vorkenntnissen? Was willst du genau wissen?
Grüße Christine
kann mir jemand in kurzfassung schreiben, wie das vorgehen
wäre und wo fehlerquellen liegen können´?
also zb wenn ich ein Gen mit einem GFP gekoppelt in Ecoli vermehren und dann zB in Arabidopsis analysieren will.
Ist es zuerst wichtig zu wissen, welche Vektorkarte ich nehmen muss und welche Restriktionsenzyme und wie das Gen überhaupt aussieht, bevor ich es einbringe, oder?
Hallo Joyner,
In aller Kürze:
SEQUENZ BESCHAFFEN
- In PubMed>:stuck_out_tongue_winking_eye:rotein das gewünschte Protein raussuchen. Dabei den Organismus beachten.
- Im Datenblatt des Proteins weiter zur mRNA.
- Hier ggf. die FASTA-Ansicht öffnen und die mRNA-Sequenz kopieren und in ein Klonierungsprogramm (kostenfrei: Ape) übertragen.
- Im mRNA-Datenblatt Start- und Stopp-Codons der codierenden Sequenz suchen und z.B. im Klonierungsprogramm markieren
PRIMER DEFINIEREN (beispielhaftes Vorgehen)
- mRNA-Sequenz in das Programm Primer3 kopieren (Website; einfach Primer3 googeln)
- jetzt die CDS mit Klammern „[]“ oder „“ eingrenzen
- das Programm die optimalen Primer suchen lassen
- eine PCR mit den so gefundenen Primern liefert die CDS und kann mit TOPO-Klonierung in ein TOPO-Plasmid eingebracht werden
SUBKLONIERUNG PLANEN
- Effizienter wird die Klonierung, wenn schon beim Design der Primer die Schnittstellen in Zielvektoren berücksichtigt werden. Dann können die Primer zur Klonierung gleich die entsprechenden Schnittstellen tragen.
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PROBLEME
- Am ehesten kann es zu Prolemen bei der PCR kommen: man erhält entweder kein Fragment oder eben zu viele Fragmente; die PCR-Effizienz kann erhöht werden, wenn Primer ohne zusätzliche Schnittstellen verwendet werden. Dann müsste man die Schnittstellen in einer zweiten PCR hinzufügen.
Im Zweifelsfall kann auch das Verfahren der „nested PCR“ angewendet werden, um im Nachgang an eine unspezfisch abgelaufene PCR das gewünschte DNA-Fragment zu amplifizieren. Siehe hierzu Wikipedia. - Ggf. könnte das geklonte Gen für die Bakterien toxisch sein. Dann sollte man über die Verwendung von Plasmiden nachdenken, die speziell für die induzierbare Expression von Proteinen in Bakterienkulturen kreiert worden sind. Siehe hierzu beispielsweise die pET-Plasmide.
Hoffe, das hilft. Bitte schreib noch einmal, falls du noch konkrete/weitere Fragen hast.
Zuerst braucht du die Sequenz des Gens und den Vektor, auf dem sich vermutlich das GFP schon befindet. Auf der Vektorkarte siehst du die Multiple Cloning Site, dort sind alle Restriktionsenzym-Schnittstellen angegeben. Nun musst du schauen, welche dieser Enzyme keine Schnittstellen in deinem Gen haben, denn sonst zerhackst du dir dein Gen beim Verdau. Wenn du die Enzyme ausgewählt hast, kannst du dir die Primer überlegen für die PCR, die dann aus einem Teil Vektorsequenz inclusive der Schnittstelle bestehen und einem Teil Sequenz des Gens (in vielen Fällen ist das für den forward Primer ab ATG und für den reverse Primer bis zum Stopp-Codon aber ich nehme an, dass in deinem Fall das Stopp-Codon erst nach der GFP-Sequenz kommt). Wichtig ist, vorher zu überlegen, wo genau die Enzyme schneiden, damit du die Primer so kontruieren kannst, dass du nach dem Verdau noch im Leseraster bist.
Viel Erfolg!
Hallo,
die Frage ist ein wenig unspezifisch. Was für eine Art Klonierungsexperiment? Klonieren von RT-PCR Produkten (also quasi in DNA umgeschriebene mRNA) oder genomische DNA oder ausgeschnitten aus einem Plasmid?
In welchen Vektor soll kloniert werden?
Gehen wir mal vom Klonieren aus einem PCR Produkt in ein Plasmid aus. Man braucht die Sequenz des zu klonierenden Gens. Dann muss man Primer machen und die PCR mit einer Polymerase durchführen, die eine hohe Fehlerkorrektur hat, um Basenfehler zu vermeiden. Man läd die PCR auf ein Gel und macht eine Elektrophorese, schneidet die Bande aus und gewinnt das PCR Produkt. Dieses kann man zur Sicherheit noch sequenzieren.
Dann braucht man eine geeignetes Plasmid als Vektor. Zum Beispiel ein all-purpose-high-copy Plasmid. Von diesem bekommt man vom Hersteller eine Genkarte bzw. eine Restriktionsschnittstellenkarte der multiple-cloning-site. Idealerweise findet man jetzt ein Enzym, das die MCS öffnet und im PCR Produkt nur am 3’ und 5’ Ende unwesentliche Teile abschneidet. Ansonsten muss man die Überhänge mit Kleenow auffüllen und blunt-end einklonieren. Das hat aber den Nachteil, das in der Hälfte aller Fälle das Produkt verkehrtherum (antisense) im Plasmid sitzt.
Beste Grüße
Marcus Wirth
Servus,
ohne Angaben von Vorkenntnissen ist dies nicht möglich - schon gar nicht „kurz“.
Gruß,
kann mir jemand in kurzfassung schreiben, wie das vorgehen
wäre und wo fehlerquellen liegen können´?
kann mir jemand in kurzfassung schreiben, wie das vorgehen
wäre und wo fehlerquellen liegen können´?
Dazu muesste man aber noch ein paar mehr Informationen haben da es viel Faktoren zu beruecksichtigen gibt. Z. B. welcher Vector, in welchem Organismus soll der Vector vervielfacht werden.
Im Grunde analysiert man zuerst welche Restriktionsschnittstellen man verwendet. Anschliessend entwickelt man Prime die sowohl die restriktionsschnittstellen als auch ein Stueck des Genes als Anlagerungssequence beinhaltet. Mit diesen primers vervielfaeltig man das Gen von Interesse mithilfe von PCR, behandelt das PCR Produkt als auch den Vector mit den festgelegten Restriktionsenzymen und versucht anschliessend das Gen in den Vector zu integrieren. Um den Vector mit dem Gen zu vervielfaeltigen wird der Ligationsansatz in einen Organsimus, meistens E. coli, transformiert und anschliessend auf erfolgreiche Insertion ueberprueft.
Keine ahnung, sorry. Kommt total drauf an was man vorhat zu klonieren.
Ist dann jedesmal anders und in einer Kurzversion nicht zu erklären.
kann mir jemand in kurzfassung schreiben, wie das vorgehen
wäre und wo fehlerquellen liegen können´?
Tschuldigung, ich hatte diese Anfrage irgendwie wohl übersehen. Da es schon eine Weile her ist, nehme ich mal an, dass die Frage nicht unbedingt aktuell ist.
Falls Du doch noch Material suchst, hier ist eine umfangreiche Quelle zu der Thematik (allerdings Englisch…):
http://nhjy.hzau.edu.cn/kech/jycz/jczs/ml-introducti…