Re: Wie plant man ein Klonierungsexperiment

Hallo Joyner,

In aller Kürze:

SEQUENZ BESCHAFFEN

- In PubMed>

rotein das gewünschte Protein raussuchen. Dabei den Organismus beachten.
- Im Datenblatt des Proteins weiter zur mRNA.
- Hier ggf. die FASTA-Ansicht öffnen und die mRNA-Sequenz kopieren und in ein Klonierungsprogramm (kostenfrei: Ape) übertragen.
- Im mRNA-Datenblatt Start- und Stopp-Codons der codierenden Sequenz suchen und z.B. im Klonierungsprogramm markieren

PRIMER DEFINIEREN (beispielhaftes Vorgehen)

- mRNA-Sequenz in das Programm Primer3 kopieren (Website; einfach Primer3 googeln)
- jetzt die CDS mit Klammern "[]" oder "" eingrenzen
- das Programm die optimalen Primer suchen lassen
- eine PCR mit den so gefundenen Primern liefert die CDS und kann mit TOPO-Klonierung in ein TOPO-Plasmid eingebracht werden

SUBKLONIERUNG PLANEN

- Effizienter wird die Klonierung, wenn schon beim Design der Primer die Schnittstellen in Zielvektoren berücksichtigt werden. Dann können die Primer zur Klonierung gleich die entsprechenden Schnittstellen tragen.

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PROBLEME

- Am ehesten kann es zu Prolemen bei der PCR kommen: man erhält entweder kein Fragment oder eben zu viele Fragmente; die PCR-Effizienz kann erhöht werden, wenn Primer ohne zusätzliche Schnittstellen verwendet werden. Dann müsste man die Schnittstellen in einer zweiten PCR hinzufügen.
Im Zweifelsfall kann auch das Verfahren der "nested PCR" angewendet werden, um im Nachgang an eine unspezfisch abgelaufene PCR das gewünschte DNA-Fragment zu amplifizieren. Siehe hierzu Wikipedia.
- Ggf. könnte das geklonte Gen für die Bakterien toxisch sein. Dann sollte man über die Verwendung von Plasmiden nachdenken, die speziell für die induzierbare Expression von Proteinen in Bakterienkulturen kreiert worden sind. Siehe hierzu beispielsweise die pET-Plasmide.

Hoffe, das hilft. Bitte schreib noch einmal, falls du noch konkrete/weitere Fragen hast.